Градуированное каре с удлинением: Какое оно градуированное каре? Короткое, длинное или с удлинением ~ Lokon+

Содержание

Градуированное каре на средние волосы

Всем рано или поздно хочется кардинально изменить свой образ, привнести что-то смелое, необычное и дерзкое в стиль, да и в жизнь в целом. А что может справиться с этой задачей лучше, чем смена прически? Одно из самых лучших решений для этого — градуированное каре! Ведь эта стрижка прекрасно подходит обладательницам волос средней и короткой длины, а еще она выглядит очень стильно и необычно.

Градуированное каре для волос средней длины

20 смелых решений

  1. Что такое градуированное каре?
    Для начала давай разберемся, что же такое градуированное каре. Эту прическу можно назвать миксом двух базовых стрижек — каскада и классического каре. Эта стрижка отличается от обычного каре линией среза, которая имеет форму лесенки. Градуирование может быть как ярко выраженным, так и едва заметным.

    Строгая форма классического каре подходит далеко не всем девушкам, а вот градуированное каре — это поле для экспериментов. Эта стрижка подходит практически любой девушке, главное — подобрать правильную форму и сделать укладку.

  2. Градуированное каре с удлинением

    Один из самых элегантных вариантов для волос средней длины — градуированное каре с удлинением.

    Есть несколько вариантов каре с удлинением, из которых можно выбрать тот, который подчеркивает твои черты лица и тип волос. Можно больше открыть затылок, а пряди удлинить. Эта стрижка будет отлично смотреться как на прямых волосах, так и на волнистых.

  3. Короткое градуированное каре
    Градуированное каре прекрасно подходит для волос средней длины, но не менее стильно и смело оно выглядит у женщин с короткими волосами. Важно правильно расставить акценты.

    Короткое градуированное каре полностью открывает затылок, а вот боковые пряди можно оставить удлиненными. Оптимальная длина этих прядей — до линии скул.

    Сама внешность задает рисунок прически, которая делает акцент на линии шеи и выделяет овал лица.

  4. Укладка градуированного каре

    Еще один неоспоримый плюс такой стрижки — простота укладки. Чтобы прическа приобрела красивый вид, понадобится совсем немного стайлинга, а также плойка, которая сделает пряди прямыми и гладкими.

    Также тебе понадобится расческа-щетка с натуральной щетиной, чтобы придать локонам блеск и сияния.

С этой прической можно экспериментировать, и это легко, даже если ты не профессионал. К примеру, для вечернего образа можно завить элегантные локоны из боковых прядей или уложить волосы волной. С такой прической ты будешь выглядеть просто неотразимо!

Поделись этими стильными решениями с подругами!

Автор статьи

Екатерина Воронина

Главное хобби Екатерины Ходюк — литература. А еще она любит смотреть хорошее кино, наслаждаться осенью, гладить котов и слушать группу «Сплин». Увлекается японской культурой, мышлением и образом жизни японцев, мечтает побывать в этой стране. Катя стремится прожить насыщенную, полную впечатлений и путешествий жизнь. Любимая книга девушки — «Невыносимая легкость бытия» Милана Кундеры.

Градуированное каре с удлинением для женщин 40-50 лет: 10 чудесных идей | Красотка

Градуированное каре с удлинением уже достаточно много лет находится на пике своей популярности среди женщин в возрасте 40-50 лет.

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

Термин «градуировка» в переводе означает «ступенька», т.е. градуированное каре представляет собой многоступенчатую стрижку, пряди в которой сострижены на разном уровне. При этом удлиненная передняя часть прически делает женский образ более элегантным и утонченным. К слову, градуированное каре с удлинением подходит женщинам среднего возраста с любым типом внешности, а потому является универсальным.

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

Градуированное каре с удлинением женщин 40-50 лет с круглым лицом

Круглолицым женщинам в возрасте 40-50 лет прекрасно подойдет градуированное каре с удлиненными передними или боковыми прядями. Кроме того, вытянуть овал лица смогут рваные элементы стрижки и искусственно созданная многоступенчатость.

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

Градуированное каре с удлинением женщин 40-50 лет с квадратным лицом

Самым оптимальным вариантом для женщин среднего возраста с квадратным лицом является сильно профилированное градуированное каре с удлинением и косой челкой. Такая стрижка сгладит угловатые черты лица и зрительно приблизит пропорции к идеальным.

https://www.instagram.com/curtinhobrasil/

https://www.instagram.com/curtinhobrasil/

Градуированное каре с удлинением женщин 40-50 лет с овальным лицом

Для обладательниц овального лица идеальным станет вариант удлиненного градуированного каре с прямой челкой. Так, сама челка зрительно сделает лицо более миловидным. При этом прекрасно будет на таких дамах смотреться градуированное каре до плеч, где более длинные прядки расположены в области затылка. К слову, удлинять пряди у лица в этом случае запрещено, так как благодаря этому овал может стать еще более вытянутым.

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

https://www.instagram.com/meucabelocurto/

https://www.instagram.com/curtinhobrasil/

https://www.instagram.com/curtinhobrasil/

Градуированное каре с удлинением женщин 40-50 лет с треугольным лицом

Обладательницам треугольной формы лица свое особое внимание стоит обратить на те варианты градуированного каре с удлинением, где присутствуют элементы асимметрии. При этом удлиненными могут быть пряди лишь, с одной стороны.

https://www.instagram.com/curtinhobrasil/

https://www.instagram.com/curtinhobrasil/

Градуированное каре с удлинением стало настоящей находкой для женщин 40-50 лет. При правильном подборе этой стрижки к индивидуальному типу внешности дамы, получим свежий, яркий и очень привлекательный образ.

https://www.instagram.com/cabelocurto/

https://www.instagram.com/cabelocurto/

https://www.instagram.com/cabelocurto/

https://www.instagram.com/cabelocurto/

А какая прическа больше всего понравилась вам? С нетерпением ждем ваших комментариев!

Если Вам понравилась статья, сохраните к себе и поделитесь с друзьями!

Присоединяйся к нам на наши каналы в Яндекс.Дзен: Красотка, Идеи стильных людейМаникюр★нейл-арт, Гении и аутсайдеры

особенности, техника выполнения стрижки, укладка (56 фото)

Градуированное каре — это разновидность обычной, многим приевшейся стрижки каре. Градуированное каре освежает образ, молодит свою обладательницу и вносит определенную изюминку во внешний вид женщины. В данной статье рассмотрим основные особенности градуированного каре, технику выполнения данной стрижки, а также посмотрим на различные варианты укладок градуированного каре. Но обо всем по порядку.

Особенности градуированного каре

По своей сути градуированное каре — это своеобразный микс из классического каре и каскадной стрижки. Отличительной особенностью градуированного каре является укороченные пряди на затылке с удлинением к вискам и вырезом своеобразными зубчиками, обрамляющими лицо. В этом и заключается основно отличие градированного каре от классического. В классическом варианте линия среза идеально ровная, а в градуированном — похожа на лесенку. Кроме того, не стоит забывать о том, что в градуированном каре обязательным условием является наличие укороченных верхних прядей с плавным переходом на удлиненные нижние.

Основным преимуществом градуированного каре является возможность регулирования длины прядей. Это позволяет стилистам грамотно подбирать длину под форму и черты лица каждой женщины индивидуально. Эта универсальность градуированного каре подкупает многих женщин. Помимо всего прочего градуированное каре выглядит очень эффектно, как в повседневной жизни, так и на светских мероприятиях.

Техника стрижки градуированного каре

Особенность выполнения стрижки градуированное каре заключается в некой свободе парикмахера-стилиста касаемо выбора длины, ракурса градуировки и количестве ярусов. Однако структура выполнения градуированного каре всегда одинакова.

  1. Первым делом подготавливаем волосы к стрижке: моем их и тщательно расчесываем. Затем разделяем всю массу волос на три зоны: макушечную, височную и затылочную. Первые две зоны закрепляем зажимами для волос.
  2. В затылочной зоне выделяем среднюю часть волос и делаем срез без оттяжки. Этот срез называется контрольным, так как по нему будут выравниваться все оставшиеся волосы. Первый слой волос срезается во всех зонах по контрольному срезу.
  3. Переходим к формированию основы каре. С каждой зоны отделяем горизонтальным пробором слой волос и срезаем его таким образом, чтобы он накладывался на нижний слой. Начинать стрижку нужно от шеи, постепенно переходить к височным зонам, и только после височных зон стричь макушку и челку.
  4. На следующем этапе можно переходить к градуировке прядей. Для начала встряхиваем голову, прочесываем волосы в различных направлениях и устраняем выбившиеся из основной массы прядки. Непосредственно градуировка заключается в выделении отдельных прядей и создании на них филировки, как прикорневой, так и на кончиках. Стоит заметить, что только профессиональный мастер способен правильно подобрать глубину градуировки, чтобы умело скрыть недостатки и подчеркнуть достоинства женщины.
  5. На заключительном этапе осуществляется укладка стрижки с помощью фена и брашинга. Кроме того, можно выполнить укладку с помощью утюжка, главное перед этим нанести на волосы средство термозащиты, чтобы не повредить их.

Укладка градуированного каре

Укладывать такую стрижку достаточно просто. Если у вас не хватает времени на создание каких-либо сложных вариантов укладки, можно просто высушить волосы феном, приподнимая волосы от корней. Для укладки градуированного каре можно пользоваться муссами и пенками, создавать красивые локоны или мокрые укладки. Варианты укладок градуированного каре как на каждый день, так и для праздничного случая вы можете увидеть ниже.

Удлиненное градуированное каре – стрижка для всех

Градуированное каре – одна из вариаций знаменитой стрижки Клеопатры, которая выполняется на средние волосы с удлинением. С немецкого языка слово «градуировка» переводится как «ступень, шаг». Это означает, что если классическое каре выстригается ровным срезом, то градуированный вариант представляет собой многоступенчатую прическу. Техника его исполнения предполагает обработку прядей ножницами под определенным углом, слоями. Благодаря этому стрижка приобретает изюминку: даже тонкие и редкие волосы выглядят пышными и объемными.

Каре для всех

Удлиненное градуированное каре (как на фото ниже) гармонирует с любой формой лица, подходит для всех типов волос и не имеет возрастных лимитов. Одинаково эффектно выглядит как с челкой, так и без нее, с центральным или боковым пробором. Градуировка может быть интенсивной или слабо выраженной, а прическа иметь разнообразную длину – от линии подбородка до плеч. Стрижка смягчает неидеальные пропорции квадратного лица, зрительно удлиняет круглое и совершенствует черты треугольного. А вариант на ножке маскирует неидеальную линию шеи и подбородка. Стрижка способна привнести свежесть в образ своей обладательницы, значительно омолодив ее.

Рассмотрим, какие виды удлиненного градуированного каре рекомендованы для конкретных типов внешности.

Для круглого лица

Каре с удлиненными передними прядями, обрамляющими лицо, визуально удлинит его, максимально приблизив к овалу. При этом стрижка может иметь такие элементы, как:

  • удлиненные боковые пряди;
  • рваная или асимметричная челка;
  • неодинаковая структура стрижки.

Для квадратного лица

Удлиненное градуированное каре с косой челкой и рваными кончиками (как на фото ниже) поможет смягчить несовершенные линии квадратного лица и скрыть широкие скулы. А профилированные концы придадут волосам объема и воздушности, компенсируя резкие черты. Для квадратного типа рекомендуются следующие особенности стрижки:

  • косая челка средней длины;
  • профилированные кончики;
  • приподнятый затылок.

Для создания совершенного образа можно попробовать градуированное боб-каре с элементами асимметрии.

Для овального лица

Градуированное каре с удлинением – идеальный вариант для овальной формы. Стрижку можно дополнить асимметричной или взъерошенной челкой, а также профилированными прядями нижней линии волос.

Для треугольного лица

Для данного типа внешности отлично подойдет вариант с асимметрией (как на фото ниже), когда пряди на одной стороне длиннее, чем на другой. Красиво дополнит стрижку рваная челка. Можно также поэкспериментировать с кончиками волос, сделав их рваными на фоне некоторых прядей, оставленных длинными. Треугольному лицу подойдут такие элементы каре, как:

  • модная асимметрия;
  • многослойность или лесенка;
  • косая, взъерошенная или асимметричная челка.

Укладка

Удлиненное градуированное каре уложить довольно просто, для процедуры вам понадобятся укладочные средства (спрей, мусс, лак) и круглая щетка. На влажные волосы нанесите пенку или мусс, а затем высушите их феном, наклонив голову вниз и направляя струю теплого воздуха от кончиков к корням. У вас получится роскошный объем. Пряди также можно вытянуть утюжком, сделав прическу идеально гладкой и глянцевой. Не менее великолепно будет смотреться и эффект мокрых волос или легкая завивка.

Градуированное каре с удлинением не имеет противопоказаний и ограничений, стрижка уместна в любой жизненной ситуации и возрасте. Ее многогранность и универсальность по праву оценены тысячами стильных женщин по всей планете.

Стрижка градуированное каре варианты с удлинением и челкой фото

Градуированное каре не зря считается одной из самых востребованных вариаций стрижки каре. Стилисты не раз выделяли её в качестве универсальной, неприхотливой и очень стильной прически, не выходящей из моды последние несколько лет. Эта стрижка способна украсить любую девушку, выгодно подчеркнуть все её достоинства, придать лицу гармоничные пропорции, а также добавить притягательности и незаурядности внешнему облику.

Особенности стрижки градуированное каре

Женское градуированное каре представляется собой смесь нескольких техник выстригания волос: классического каре и каскада. Подобная вариация стрижки появилась экспериментальным путем, когда стилист, пытаясь подобрать разному типу женской внешности наиболее лаконичный вариант каре, миксовал, сливал разные стили и техники выстригания волос. Многослойность и ступенчатость в этом смысле решала целый ряд проблем, которые часто возникали в классическом каре. Градуировка прекрасно гармонировала с разной формой лица, позволяла наиболее эффективным образом производить коррекцию и моделирование пропорций, а самое главное, выглядела живой, динамичной, интересной и воздушной.

Каре с градуировкой подходит почти всем. Оно отлично смотрится как на прямых, так и на вьющихся волосах. Опытный мастер с использованием техники многослойного выстригания способен подобрать разному типу лица идеальный образ, сочетающий в себе индивидуальность, стиль и легкое кокетство. Возраст также не является помехой для этой стрижки. Дамам в почтенном возрасте можно выбрать стрижку, приближенную к классической модели, с добавлением легкой градуировки, а молодым бунтующим натурам – варианты с рваными концами, асимметрией, сложным рисунком и хулиганской челкой.

Градуировка подразумевает под собой многослойную структуру стрижки. В градуированном каре она бывает легкой, средней или усиленной.

Виды градуировки и варианты стрижек

Подбирая наиболее подходящий вариант стрижки, мастер преимущественно использует три основные вариации градуировки волос: слабую, среднюю и усиленную. Слабая градуировка подразумевает легкую многослойность только на концах волос и больше подойдет для ситуаций, когда хочется немного видоизменить классическое каре, добавить изюминку, уйти от лишней серьезности в образе. Средняя градуировка используется для придания объема в определенной части лица, для моделирования пропорций, формирования динамичной, живой стрижки. И наконец, усиленная многослойность с обработкой всей копны волос создается в случаях, когда хочется сделать необычный образ, полностью уйти от классики, приблизиться к молодежным, свободолюбивым, раскрепощенным тенденциям.

Преимущественно градуированное каре делается на среднюю и короткую длину волос, но иногда также встречаются удлиненные варианты прически, ниже средней длины. Градуированное каре на короткие волосы бывает следующих видов: каре на ножке и боб-каре. На средней длине выстригаются боб-каре, удлиненное каре и каре на вьющихся волосах. Все указанные выше вариации могут делаться с челкой.

Градуированное каре на ножке

Такое каре подразумевает наличие короткого, полностью открытого затылка, на котором появляется тонкая ножка из волос. Эта область выстригания делается многослойной и объемной. Где-то в районе мочки уха или его середины начинает формироваться основная длина волос. Боковые и лицевые пряди могут выстригаться прямым срезом с легкой, едва заметной градуировкой или же иметь рваные контуры и неравномерную длину. Перья и острые концы волос у лица помогают избавиться от чрезмерного объема в районе щек и скул, а также удлиняют овал лица. Кроме того, асимметричные линии и средняя градуировка – это отличный вариант молодежной стрижки, соответствующей основным модным направлениям.

Градуированное боб-каре

Градуированное боб-каре прекрасно подойдет женщинам с тонкими волосами. Эта стрижка хорошо оформляет объем, делая волосы визуально более густыми и пышными. Принцип оформления стрижки основан на классическом выстригании боба с элементами каре, а также в добавлении многослойности, текстуры за счет градуировки. Затылок получается по длине короче, чем лицевые пряди. В задней части головы переходы в длине волос стараются делать менее выраженными, плавными. Чаще всего градуировка делается усиленной по бокам и у лица, в редких случаях используется средняя градуировка по всей длине. У лица пряди могут иметь ступенчатый срез и элементы лесенки. Это позволяет сделать определенные акценты, сформировать пропорции.

Градуированное каре – универсальная прическа, подходит всем, вне зависимости от формы лица, возраста или структуры волос. Необходимо только выбрать подходящую разновидность каре и способ градуировки.

Удлиненное градуированное каре

Делается такое градуированное каре на средние волосы. Длина может достигать подбородка, доходить до плеч или спускаться немного ниже. Благодаря неравномерному выстриганию и многослойной технике эта стрижка очень многолика. Классический и более спокойный вариант стрижки – обычное длинное каре с добавлением легкой градуировки. Или же два более смелых варианта: сочетание каре с каскадом или лесенкой и градуированное каре с удлинением. В первом случае мастер выстригает передние пряди короче задних, делает их неравномерными и рваными. Лицо обрамляется ступенчатыми локонами. А во втором варианте, наоборот, передние пряди получаются значительно длиннее волос по бокам и на затылке, имеют острый срез и резкие концы.

Градуированное каре на вьющиеся волосы

Вьющиеся пряди вполне лаконично и достойно смотрятся на средних стрижках градуированного каре. При выстригании боба-каре следует учитывать особенности структуры волос и не делать затылок слишком коротким. Выбирая удлиненное каре, необходимо быть осторожным с оформлением лицевых локонов. Не стоит чрезмерно их укорачивать. Прекрасным вариантом может стать каре с длинными передними прядями. Градуировка поможет оформить непослушные завитки, сделать стрижку динамичной, игривой, немного небрежной. На вьющихся волосах лучше делать градуированное каре без челки. В крайнем случае она должна быть удлиненной.

Градуированное каре с челкой

Челка – очень важный и значимый элемент каре. Она имеет различные формы и вариации. Интересно и стильно смотрятся идеально прямые челки с ровным срезом и резкими углами. При этом само каре может быть неравномерным, асимметричным и рваным. Густые профилированные челки также отлично впишутся в общую задумку градуированной стрижки. Их можно уложить прямо и ровно или на бок. Большой популярностью в последние годы пользуются косые, неравномерные, удлиненные челки. Они делаются как на коротких, так и на средних стрижках. Такая челка помогает скорректировать форму лица, сделать облик женщины интересным, необычным, экстравагантным и очень стильным.

Техника стрижки градуированное каре

Схема стрижки градуированное каре выглядит следующим образом:

  1. Первым делом следует поделить чистые влажные волосы на зоны. Тонкие, не очень густые волосы можно общей копной собрать на макушке в пучок. Используйте метод «прядь на прядь».
  2. Начните стрижку с затылка. Контрольный локон формируется с первой пряди на шее. Все последующие затылочные пряди с ориентиром на контрольную отчесываются по горизонтали четко вниз и состригаются.
  3. Далее формируется контрольная прядь на виске. Височная прядь ориентируется на длину затылка, продолжая его линию среза. Все остальные височные пряди стригутся аналогичным затылку горизонтальным пробором.
  4. Приступайте к теменной зоне. Первая прядь, самая близкая ко лбу, станет контрольной. Определите её длину и срежьте. Далее вся макушка стрижется параллельным пробором с ориентацией на контрольный локон. Пряди поднимаются и стригутся перпендикулярно голове. Если в стрижке задумывалась челка, она должна выстригаться отдельно на выделенном для нее участке теменной зоны у лба. В такой ситуации контрольный теменной локон начнется сразу же за челкой.
  5. Технология стрижки градуированное каре подразумевает соблюдение плавных переходов в длине при выстригании волос от макушки к затылку. Поэтому не стоит спешить с завершением стрижки, следует повторно пройтись по волосам, подровнять углы, сделать окантовку, провести филировку прядей по всей длине, добавить задуманные акценты, асимметрию, рваный эффект и т.д.

Единственный недостаток градуированного каре – необходимость постоянной укладки и коррекции. Без этого стрижка быстро потеряет опрятный и ухоженный вид.

Укладка каре

Можно предложить следующие способы укладки:

  • Строгая и прямая. Вся шевелюра вместе с челкой выпрямляются и ровно укладываются концами волос строго вниз или с легким закруглением кончиков к лицу.
  • Свободная. Волосы сушатся феном и укладываются в хаотичном порядке. Челка также приобретает воздушную, небрежную форму.
  • Романтичная. Пряди слегка завиваются и кокетливо укладываются в прическе. Челку и затылок при этом можно сделать прямыми, а волны организовать только в районе лицевых прядей.
  • С эффектом влажных волос. Хорошо смотрится на вьющихся волосах. Локоны при помощи пены или геля формируют руками и дают им самостоятельно высохнуть.
  • С использованием аксессуаров. Для каре актуальными будут легкие ободки и заколки. При этом основная копна волос может быть как волнистой, так и прямой. Все зависит от задумки автора.

Фото

Видео

Стрижка градуированное каре на короткие, средние и длинные волосы » WomanMirror

Для тех, кто привык шагать в ногу с модными тенденциями, но не готов много времени тратить на повседневную укладку, женская стрижка градуированное каре – оптимальный вариант. Данная прическа уже не один сезон занимает ведущие позиции в каталогах модных причесок, которые всегда выглядят стильно, молодежно и эффектно.

Как правильно сделать стрижку градуированное каре?

  1. Стрижка выполняется на чистых влажных волосах. Для придания прядям скошенного вида, следует чуть наклонить голову вперед и в таком положении выполнять стрижку.
  2. Затылочную часть разделите на пять горизонтальных частей (уровней стрижки). Заколите пряди заколками. Начинайте стрижку с края, двигаясь вперед и к противоположному боку. Не забывайте формировать боковые пряди длиннее, чем на затылке.
  3. Начиная от затылочной части, прорабатывайте волосы, создавая градуировку. Каждую часть волос простригайте под острым углом, плавно двигаясь к верху.
  4. Расчешите шевелюру, форма прически должна создавать гладкую структуру, переходить от коротких прядей затылка к более длинным нижним волосам. Подровняйте срезы и длину прядей с обеих сторон лица. Стрижка готова!

Что следует знать о стрижке градуированное каре?

Форма прически создается с помощью ступенек, выполненных техникой наложения пряди на прядь. При этом верхние пряди выстригаются короче, чем нижние. Изначально, за основу берется схема классического каре, на основании которого и делается поэтапная градуировка. Концы срезов для больше плавности линий простригаются филировочными ножницами.

  • Инструкция выполнения градуированное каре сзади предполагает несколько вариантов оформления прически: градуированные пряди могут быть сформированы как по всей окружности головы, так и проработаны лишь в затылочной или височной части. В итоге, результат может принимать необычные формы от лаконичной, почти ровной прически до озорной рваной стрижки.

  • Неоспоримым преимуществом данной стрижки являет то, что она позволяет варьировать длину волос, подчеркивая или скрывая некоторые нюансы внешности. Так, короткое градуированное каре подойдет девушкам, желающим сделать акцент на красивой, тонкой шее, а градуированное каре с удлинением– идеально скроет объемную шею или ее не привлекательный внешний вид.
  • Короткое градуированное каре всегда привлекает особе внимание к лицу, поэтому стоит учитывать в своем повседневном макияже этот нюанс и относится к нему с особой тщательностью.
  • Стрижки градуированное каре с челкой или без нее отлично подойдут как для молодых девушек, так и для солидных дам. Вариативность схем исполнения позволяют придать прическе как более строгую лаконичную форму, так и растрепанный молодежный вид.

  • Удлиненное градуированное каре отлично позволяет экспериментировать со своей внешность. Для смелых девушек возможен вариант асимметричного исполнения, когда с одной стороны прядки обстригаются более коротко, переходя плавной линией по затылку в удлиненные пряди с другой стороны. Кроме того, пикантность и новизну прическе может придать даже элементарный пробор, выполненный асимметрично, на бок или зигзагом.
  • Эффектно смотрится стрижка градуированное каре с челкой. При этом форму и характер укладки можно подобрать в соответствии с особенностями вашей внешности. С такой прической сочетаются гладкие, ровные челки, доходящие до бровей, укороченные дугообразные, легкие косые челки, подчеркивающие творческий беспорядок образа.
  • Не станет такая прическа табу и для вьющихся волос. Наоборот, пошаговое простригание прядей позволяет сформировать объемную прическу, не допуская спутывания прядей.
  • Особенно эффектно градуированное каре на длинные волосы смотрятся с различными вариантами окрашивания и колорирования. Такой прием поможет придать визуальный объем и структурированность прическе.

Градуированное каре и форма лица

Подбирайте длину и форму градуированного каре с учетом особенностей вашей внешности.

  • Для девушек с овальной формой лица подойдет любая форма прически.
  • Лицам с резкими чертами- квадратной или треугольной формы, такая прическа поможет немного смягчить овал лица.
  • Узколицым девушкам рекомендуется делать стрижки градуированное каре с челкой. При этом челки могут быть как прямыми, так и дугообразными, косыми, пышными или рваными.
  • А вот девушкам с круглым лицом такая прическа вряд ли подойдет, так как она за счет скругленной формы придаст еще больший объем лицу. Наилучшим вариантом для круглолицых считается стрижка каре-боб с прямыми удлиненными прядями, ниспадающими у лица.

Экспериментируем с образом: варианты укладки

Градуированное каре на средние волосы – классический вариант прически, который позволяет с легкостью создавать как повседневные, так и праздничные укладки своими руками в домашних условиях. Рассмотрим наиболее удачные варианты.

Повседневная укладка

  1. На влажную шевелюру нанесите немного мусса, который поможет придать дополнительный объем прическе.
  2. Сушите шевелюру феном с помощью брашинга, немного подкручивая кончики по направлению к лицу. Такой вариант укладки в своем повседневном образе зачастую используют такие звезды как Рейчел Тэйлор, Перис Хилтон, Кэти Холмс.
  3. Альтернативным вариантом укладки может стать вариант, когда пряди высушиваются в обратном от лица направлении – концами наружу. Такая эффектная укладка отлично разнообразит ваш повседневный облик. Этим приемом удачно пользуются при создании ежедневного образа Кирстен Данст и Кира Найтли.

Волнистая укладка

  1. Нанесите на пряди немного фиксирующего мусса и средство с термозащитными свойствами.
  2. Поэтапно завивайте локоны щипцами или утюжками для волос. Самостоятельно варьируйте ширину и упругость локонов, в соответствии с задуманным исполнением. Градуированное каре на средние волосы, исполненное с такой укладкой, излюбленный прием для выхода в свет Гвинет Пэлтроу, Джессики Симпсон и Шарлиз Тэрон.

Эффект «мокрых волос»

Градуированное каре на короткие волосы позволяет добиться эффекта хаотичного беспорядка с помощью несложной укладки.

  1. Для требуемого эффекта нанесите на шевелюру гель для укладки или воск, тщательно прорабатывая пальцами кончики прядей.
  2. Высушите волосы феном, придавая им требуемую форму.

Градуированное каре на длинные волосы – отличный вариант особенно не заморачиваясь, придать своему облику изысканную женственность. Варианты стрижки, форма укладки, наличие челки или смещение пробора – любой штрих позволяет придать этой прическе новое звучание. Что делает стрижу поистине универсальной, а это, несомненно, придется по душе современным модницам, смело экспериментирующим со своей внешностью.

Видео: техника стрижки градуированное каре

Градуированное каре: идеи стрижки с челкой и без

Градуированное каре: идеи стрижки с челкой и без: UGC

Градуированное каре, фото которого можно увидеть ниже, пользуется всё большей популярностью. Это и не удивительно, ведь стрижка универсальна. Она подходит любому типу лица и женщинам всех возрастов.

Градуированное каре: особенности, достоинства и недостатки

Каре градуированное, в отличие от привычного варианта прически, отличается удлиненными волосами около лица и укороченными — в области затылка. В переводе с немецкого graduiren означает ‘ступень или шаг’, поэтому парикмахер выстригает пряди ступенчато, достигая эффекта градуировки.

Градуированное каре с удлинением, по мнению специалистов, идеально смотрится на всех представительницах прекрасного пола с любым типом лица. Обусловлена эта особенность стрижки тем, что для каждой девушки можно подобрать собственный вариант прически, который подчеркнет достоинства формы лица и скроет недостатки.

Эталоном считается лицо овального типа, поэтому дамам, которым посчастливилось иметь такую внешность, можно делать любой вид каре на удлинение.

Девушкам с круглым лицом лучше обратить внимание на прическу с удлиненными прядями на висках. Это поможет визуально сузить и вытянуть лицо.

Если форма его квадратная, идеально подойдет стрижка с косой челкой, поскольку она помогает скрывать широкие скулы.

Дамам, у которых высокий лоб, рекомендуется остановить выбор на стрижке с удлиненной челкой. Таким образом удастся привлечь внимание к нижней части лица.

У каре этого вида много преимуществ:

  • подходит любому типу лица и волос;
  • поможет визуально сделать тонкие пряди более объемными;
  • скорректирует овал лица;
  • не требует постоянной укладки плойкой или утюжком, прекрасно выглядит и без них;
  • может быть выполнено на волосах любой длины.

Однако существуют у каре и недостатки:

  • требует посещения проверенного и опытного парикмахера, поскольку придать нужную форму волосам сможет не каждый;
  • нужна периодическая корректировка формы.
Фото: pexels.com: UGC

Читайте также: Прически на короткие волосы с челкой пошагово

Градуированное каре: модные идеи

Вариаций прически огромное множество, но мы познакомим вас с наиболее востребованными:

Стрижка для волос средней длины

На прядях этой длины можно создать массу вариантов прически. Каре до плеч идеально подходит женщинам, которые хотят обновить образ и сделать его легче, при этом не сильно отстригать длину. Несомненное преимущество прически на средние волосы — возможность собрать их в пучок или хвост.

Градуированное каре на короткие волосы

Обладательницам коротких прядок не следует расстраиваться: каре отлично смотрится и в этом случае. Волосы около лица должны доходить до середины скулы, а вот пряди сзади могут быть совсем укороченными.

Стрижка визуально сделает женщину моложе. Помните, что этот вариант не подходит для представительниц прекрасного пола с круглой формой лица.

Боб-каре

Прическа отличается округлыми формами и особым объемом. Незаменима она для дам с тонкими волосами. Подойдет для любого типа лица, однако особой популярностью пользуется у дам в возрасте, поскольку визуально отнимает несколько лет.

Удлиненное каре с челкой

Челка дополняет прическу, делает образ завершенным. Рваную, косую или прямую подбирают в зависимости от типа лица, ведь она, как и градуированное каре, способна скорректировать его форму.

Градуированное каре без челки

Обратить внимание на этот вариант могут девушки с любой формой лица. Однако если оно круглое или квадратное, то лучше делать боковой пробор. Таким образом удастся уравновесить пропорции лица и сделать стрижку более интересной.

Чтобы выбрать подходящий вариант прически, определитесь с формой лица. Если самостоятельно сделать это не удается, проконсультируйтесь со стилистом.

Оригинал статьи: https://www.nur.kz/family/beauty/1812476-graduirovannoe-kare-idei-strizki-s-celkoj-i-bez/

стильно и практично 🚩 асимметричное длинное каре 🚩 Прически

Удлиненный боб: стрижка и укладка

Длина волос при нарощенном каре должна быть чуть выше плеч. Волосы можно подстричь гладко, или сделать более длинные пряди волос сзади или спереди. Эту стрижку можно сделать как с челкой, так и без нее. И в том, и в другом случае прическа будет выглядеть гармонично и стильно даже после простой укладки с помощью расчески и фена. Удлиненные каре помогут скорректировать лицо.Эта стрижка скроет пухлые щечки и широкие скулы, смягчит строгую линию подбородка. Каре с челкой зрительно утончит длинный нос и скроет узкий лоб. Эта прическа подчеркивает линию шеи.

Удлиненное каре укладывается с расческой и феном. Нужно расчесать слегка влажные волосы и разделить их на пробор. Начинайте с затылка, постепенно двигаясь к вискам и макушке. Чтобы придать волосам объем, их можно слегка начесать у корней. Закрученные внутрь волосы по бокам на круглую расческу.Можно использовать большие бигуди, накручивая на них подсушенные волосы. Затем надо высушить феном и зафиксировать лаком.

Если каре выполнено с челкой, начните с него, а затем приступайте к затылку.

Варианты удлиненного каре

Эту стрижку можно выполнить двумя способами: асимметричное удлиненное каре и градуированное каре с удлиненными прядями. Асимметричное каре имеет длинные пряди от лица, к спине они становятся короче, открывая шею.

Асимметричное удлиненное каре возможно для добавления бликов или окрашивания.Эта прическа будет выглядеть очень стильно.

Удлиненная градуированная каре выполняет «лесенку», поэтому строгие линии стрижки немного размыты. Этот способ более женственный и мягкий. Стрижка более объемная, волосы выглядят густыми и пышными.

Прическа с длинными передними прядями также называется «Боб». Затылок подстрижен вплотную, а передние пряди сделать более длинными. Эта прическа может быть с челкой или без, ее можно сделать с прямым, косым или зигзагообразным пробором. В любом случае эта стрижка будет выглядеть стильно.

Укладка удлиненного градуированного каре также не займет много времени. Понадобится фен, круглая расческа для волос и несколько заколок. Намочите волосы, расчешите их. Расставание. Разделите волосы на несколько зон: заднюю зону и две боковые. Отделите верхний слой волос, чтобы он не мешал. Высушите волосы на затылке. Затем приступайте к остальным волосам. Аккуратно снимите зажимы с верхней части прядей и распределите их по уже высохшим и высушите феном. То же самое нужно сделать с боковыми прядями волос.

Брюнетки с квадратным лицом. Модные стрижки для квадратной формы лица

Стрижки для квадратной формы лица одни из самых простых и применимых для повседневной носки. Они характеризуют властность обладательницы прически, ее сильный характер, помогают в полной мере раскрыть женскую красоту.

Для такого типа внешности в первую очередь подходят пробор и челка. Асимметричные линии закрывают углы. Дугообразную челку также можно использовать для визуального округления лица, а в качестве укладки использовать небольшие легкие волны.

Для лица, имеющего квадратную форму, категорически не подходят разного рода графичные стрижки, в которых срез располагается в области подбородка. Специалисты также не рекомендуют делать локоны завитыми в обратную сторону. Коротких стрижек лучше избегать, так как лицо будет находиться в открытом положении, а его заостренные черты будут бросаться в глаза.

Стрижки для квадратного лица должны гармонировать с овалом. Сгладить четкие контуры и визуально сузить лицо

Особенности квадратной формы лица

Основным признаком квадратной формы лица является одинаковая длина лба, скул и щек.Еще один признак – прямоугольный подбородок.

Представительницам прекрасного пола с такими особенностями внешности в первую очередь подходят стрижки на длинные волосы. Они помогают зрительно удлинить лицо и сделать черты тоньше. Для смягчения образа принято создавать объем в области макушки.

Любительницам необычных стрижек может подойти лесенка или каскад, важный элемент в создании укладки – асимметричные черты. Желательно избегать выбора прямых челок, так как они акцентируют внимание на форме лица.

Что скрыть и что подчеркнуть

Чтобы подбородок не выглядел таким «тяжелым», лучше сделать визуальное закругление челкой, которую можно просто зачесать набок. Асимметрия еще лучше.

Если есть желание сделать квадратную форму лица уже и немного удлинить ее, то подойдут прямые локоны до плеч. Каскадные стрижки, выступающие своеобразным обрамлением, используются для сглаживания грубых черт лица. Эта прическа всегда придает образу мягкости и женственности.Стилисты отмечают, что идеальные прически для обладательниц такого типа лица начинаются чуть ниже плеч.

Слишком короткие стрижки категорически противопоказаны из-за того, что получается эффект открытости. Вариант такой прически возможен только при соблюдении нескольких строгих правил. Во-первых, нужно избегать гладкой укладки волос, обязательным условием является добавление объема. Во-вторых, если у вас есть челка, лучше использовать укладку на бок. В-третьих, чтобы сделать образ более загадочным, при укладке рекомендуется использовать волны.

Если все-таки очень хочется решиться на короткую стрижку, то лучше выбрать боб в удлиненном стиле. Асимметрия сделает лицо более привлекательным и милым.

Короткие стрижки для квадратного лица

Самое главное условие при выборе укороченной прически – неровные линии. Стрижки пикси будут смотреться только с длинной челкой в ​​косом варианте. Важно, чтобы с обеих сторон были элементы асимметрии. Этот образ подойдет и девушкам, чьи локоны имеют мягкую структуру, немного завиваются.Это придает лицу определенное изящное обрамление.

Слишком короткие стрижки совершенно не улучшат внешность девушки, а наоборот, продемонстрируют невыигрышные черты внешности. Слова гарсон и каре лучше вычеркнуть из списка желаний.

Длина волос до подбородка также не украсит представительниц прекрасного пола, и совершенно неважно, какая вариация стрижки будет использована. Прическа акцентирует внимание на жестких линиях в нижней части лица.Старайтесь избегать ровной длины и прямых проборов, они не помогут создать изящный и грациозный образ.

Стрижки на средние волосы для квадратного лица

При выборе стрижки на среднюю длину лучше ориентироваться на асимметричные черты лица. Удлиненный боб – идеальный вариант, который порадует романтичными и изящными волнами. Эта прическа аккуратно акцентирует внимание на красивых скулах, четкий низ лица визуально смягчают волнистые локоны.

Ограничений в выборе челки практически нет, здесь можно дать волю фантазии. Единственное, что лучше не использовать в создании образов – это прямая длина. Элегантный вариант, когда челка слегка прикрывает брови. Специалисты рекомендуют использовать филировку и рваные концы.

Градуированные стрижки также отлично подходят для квадратных лиц. Форма каскада уравновешивает слишком четкие черты, придавая плавность. Самые короткие пряди лучше оставить у скул, затем локоны следует удлинить.

Длинные стрижки для квадратного лица

Длинные пряди, плавно ниспадающие на плечи обладательницы лица квадратной формы, только украсят ее внешность и сделают образ более завершенным. Для создания романтического стиля используются слегка завитые, воздушные пряди. Волны рекомендуется делать примерно от середины волос, так скулы получат дополнительное обрамление.

Лесенка с косой и слегка рваной челкой – самый идеальный вариант. Каскадность и многослойность в образе украшает лицо, имеющее исключительно ярко выраженные черты.

Чтобы сделать линии подбородка более мягкими, стилисты советуют укладывать локоны ближе к области подбородка. Совсем не обязательно прятаться за волосами, скорее стоит создать слегка небрежный вид.

Челка, какую выбрать

Иногда первым шагом к выбору наиболее подходящего типа стрижки является изменение формы челки.Эта деталь способна сделать образ более строгим или романтичным, а также добавить или убавить годы. Девушкам с квадратным лицом следует быть осторожными с выбором и корректировкой челки.

Есть несколько деталей прически, которые могут стать хорошим вариантом для формирования образа. К ним относятся длинные косые, асимметричные, мелированные и филированные челки.

Длинная косая челка добавляет образу немного сексуальности и женственности. Обязательным условием его наличия является правильная длина.Завитки должны заканчиваться чуть выше или чуть ниже линии подбородка. Рваные края помогают скрыть угловатые черты.

Если челка длинная, то ее пряди можно немного накрутить с помощью бигуди или плойки. Зачесывание прядей назад и закрепление невидимками тоже может стать удачным вариантом.

Косая асимметрия добавит образу игривости. Мелирование придаст дополнительную яркость и сделает прическу более интересной.

Прямая короткая челка – запретный вариант для женщин с квадратными чертами лица.Слишком густые локоны у лба утяжеляют прическу, поэтому лучше прибегнуть к филировке.

Особенности укладки при квадратной форме лица

Девушкам с квадратным лицом идеально подойдет высокий хвост или зачесанные назад волосы. Слишком большой объем в области скул будет излишне привлекать внимание к проблемной зоне.

Для смягчения угловатости скул активно используются завитые локоны. Они не только добавят образу романтичности, но и сделают его более аккуратным и гармоничным.

Украшения, аксессуары и правильно подобранный макияж дополнительно помогут сделать образ более завершенным и выразительным.

При выборе стрижки важно ориентироваться не только на свои предпочтения, но и на свой тип лица. Это поможет вам скрыть некоторые недостатки внешности и выделить все достоинства. В этой статье мы узнаем, какие стрижки подходят для квадратного лица, приведем фото некоторых из них для наглядности, а также рассмотрим их виды.

Особенности стрижки для квадратного лица

Кому подходят стрижки для квадратного типа лица?

Естественно, такие стрижки подходят девушкам с похожей внешностью. Также некоторые виды идут девушкам с круглым и треугольным типом лица. Кроме того, нужно ориентироваться на свой возраст и стиль. Ниже мы приведем вам виды стрижек, и это поможет вам выбрать для себя тот вариант, который подойдет вам по всем параметрам.

боб без челки

Способы оформления стрижек

Взрыв

Для квадратного лица допустимо наличие в стрижке челки.Однако важно, чтобы она не была длинной и прямой. В этом случае подойдет короткая взлохмаченная челка или косая челка, как длинная, так и короткая.

Расставание

В этом случае не рекомендуется носить прическу с прямым пробором. Ее лучше сместить немного в сторону, чтобы выровнять пропорции лица. Кроме того, допустим пробор, сделанный зигзагом. Это будет выглядеть оригинально и креативно.

удлиненные пряди

Хорошо будут смотреться в этом случае удлиненные редкие пряди, спускающиеся вдоль лица.Они помогут скрыть угловатость, что положительно скажется на внешности. Кроме того, удлиненные пряди зрительно удлиняют лицо, тем самым выравнивая пропорции.

каскад на длинные волосы

Выбор стрижки

Есть несколько правил, которых стоит придерживаться при выборе стрижки для квадратного лица.

  1. Ты не можешь полностью открыть лицо. Пряди должны стекать по щекам, чтобы скрыть резкие черты лица. Если разместить все волосы на макушке и затылке, то выставить угловатость на всеобщее обозрение.
  2. Не рекомендуется концентрировать всю массу волос на уровне от середины уха до подбородка. Это сделает лицо непропорциональным и подчеркнет все ваши недостатки.
  3. Не нужно выбирать стрижки с прямыми длинными волосами. В противном случае он утяжелит челюсть, а лицо станет непривлекательным.
  4. Не желательно, чтобы длина прически или ее отдельных прядей располагалась на уровне подбородка. В противном случае челюсть визуально будет выглядеть массивной и это испортит внешний вид.
  5. Нельзя делать слишком короткие стрижки, полностью открывающие лицо, иначе это подчеркнет его угловатость.

укороченный боб с боковой челкой

Методы укладки

Стрижки для квадратного лица, фото это показывают, должны быть уложены особым образом. Основная масса волос в этом случае должна быть сосредоточена на макушке, но полностью открывать лицо нельзя. Чтобы сделать такую ​​прическу, вам понадобится фен, круглая расческа и закрепитель.Для начала вымойте волосы и уложите их так, как того требует ваша стрижка. Далее сделайте небольшой начес на макушке и закрепите его.

Кроме того, квадратному типу лица подойдет прическа с легкими волнами. Их можно сделать с помощью бигуди или плойки. Локоны также должны струиться вдоль лица, а на макушке сделать небольшой начес.

средняя длина

Виды стрижек для квадратного лица

Каскад

Это одна из самых удачных стрижек для квадратного лица, если сделать ее правильно.«Лестница» в этом случае должна идти от середины виска. Челку можно сделать как косой, так и короткой. Что касается укладки, то в этом случае лучше всего, если концы локонов «смотрят» наружу.

Каре

Каре для квадратного типа лица выполняется следующим образом. Затылок приоткрывается или полностью открывается, а пряди спереди удлиняются, опускаясь ниже подбородка. Основная масса волос сосредоточена на макушке. Допускается удлиненная косая челка, сливающаяся с прядями на щеках.Короткая взлохмаченная чурка также приемлема, если стиль позволяет ее «носить».

асимметричная стрижка

Асимметричная стрижка поможет вам «замаскировать» недостатки лица, такие как мощная челюсть, крупный нос и массивные скулы. Это выровняет пропорции и сделает резкие черты более плавными. Асимметрию можно выполнять на любую сторону, это не имеет значения. Челка в этом случае допускается как короткая прямая, так и косая любой длины. Пробор прямой или зигзагообразный, в зависимости от предпочтений.

Длинные волосы

Как было сказано выше, длинные прямые волосы для квадратного типа лица недопустимы. Однако если сделать кудри, то смотреться будет хорошо. Острые черты лица «сгладятся» и приобретут красивые пропорции, а не угловатость. При этом следует учесть, что локоны не должны быть слишком крупными, чтобы не «утяжелять» челюсть. Подойдут средние локоны или волны. Для длинных волос их можно делать даже утюжком, но выпрямлять их не рекомендуется.

пикси с челкой

каскад на волосы средней длины

каскад на длинные волосы

каскад на вьющиеся волосы без челки

укороченный боб с густой челкой

классический боб

боб с удлинителем

боб с окрашиванием омбре

с объемной укладкой

боб с боковой челкой

каскад на прямые волосы без челки

боб со светлыми волосами

темный боб

градуированное каре с удлинением

каскад на длинные вьющиеся волосы

укороченный боб

классический боб без челки

Стрижки для квадратного лица, фото это подтверждают, должны быть объемными, а челка не должна быть прямой и густой, как вы уже видели.Обратите внимание, что приведенные нами примеры причесок не имеют ограничений по возрасту или стилю. Зная правила их выполнения и установки, вы сможете подобрать для себя наиболее подходящий вариант.

Прическа – это своеобразное украшение женского облика. Она может преобразить девушку, как в лучшую, так и в худшую сторону. Поэтому к формированию укладки волос нужно подходить очень внимательно, чтобы не испортить природную красоту. Для начала нужно определить свой тип лица, а уже потом подбирать к нему подходящую прическу.А стилисты разработали специальные схемы работы с волосами каждой женщины индивидуально. По этому принципу будут предлагать стрижки для квадратного лица , овального, продолговатого, треугольного или круглого, чтобы не только не портить визуальную картину, но и корректировать некоторые проблемные зоны.

Стрижки для квадратного лица

При выборе стрижки для лица, форма которого приближается к квадратной, важно убедиться, что тип действительно такой. Для этого нужно встать перед зеркалом, убрать волосы назад, а затем обвести контуры лица на зеркальной поверхности губной помадой или фломастером.Если высота по центральной осевой линии от волос до подбородка и ширина от скулы до скулы примерно равны, а подбородок имеет угловатые массивные черты, то это именно квадратная форма. В этом случае пропорции корректируются с помощью правильной стрижки, которую можно подобрать на основе правил, разработанных специалистами.

Средний образ квадратного лица

Данному типу подходят самые объемные стрижки. А вот гладкие прически женщинам с квадратной формой лица не подходят, ведь плотно прилегающие волосы лишь подчеркнут некую угловатость и привлекут внимание к грубым чертам.

Вы можете создать объемную стрижку, градуируя волосы и используя рваные пряди. В том числе для квадратного лица рекомендуются стрижки каскад, лесенка, а также асимметричные стрижки.

Асимметрия в прическе сглаживает угловатость лица, и оно становится более мягким и женственным. Идеальный выбор для квадратной формы – многослойная стрижка. Она особенно подходит женщинам с волнистыми или вьющимися волосами, которые с такой прической будут смотреться потрясающе.

Оливия Уайлд сделала правильный выбор в пользу косой челки

Анджелина Джоли – одна из самых известных обладательниц квадратного лица.

Секрет удачной стрижки для квадратного лица заключается в технике стрижки и объемной укладки, которые особенно важны для этой формы. Поэтому короткие стрижки типа «Гарсон» и «Пикси» рекомендуются для квадратного лица, но с объемными волосами. Главное, не укладывайте волосы гладко. Пряди нужно приподнять, что придаст объем у корней, а асимметричную челку уложить набок. Эта укладка может сбалансировать пропорции.Красиво смотрится на девушках с квадратным лицом короткая стрижка, пряди которой уложены волнами. Лучший вариант для этого – создать красивую укладку в стиле ретро.

Короткая стрижка боб также отлично подходит для каре, которое отлично смотрится с асимметричной короткой челкой, уложенной набок. Вообще при таком типе лица асимметричная стрижка смотрится на волосах любой длины – коротких, средних или длинных.

Сандра Буллок с очаровательной короткой стрижкой

Асимметрия – лучшее решение для квадратного лица

Короткие стрижки

Короткие стрижки для квадратного лица , как каскад или боб-каре, создают объем за счет многослойности и ошеломляющий.Прически на вьющиеся волосы выглядят особенно женственно и стильно вообще без челки или с не очень густой, прореженной прямой или косой челкой. Девушкам с длинными волосами можно сделать «каскад», градуированный выше уровня скул. Очень красиво смотрятся стрижки с ровными срезами длинных волнистых волос, к которым подходит и такой вид стрижки, как «Рапсодия». Стилисты рекомендуют как наиболее подходящие варианты другие, например, «Дебют», «Гаврош», стрижку Леры Кудрявцевой, каре с удлинением передних прядей или на ножке.Выбирая гармоничный образ, следует постараться смягчить увесистые линии с помощью аксессуаров, которые также смогут зрительно вытянуть лицо и округлить форму подбородка.

Кира Найтли с короткой стрижкой

Натали Портман. Актрисе очень идет такая суперкороткая стрижка

Также подойдут и средние стрижки для квадратного лица , способные зрительно сузить подбородок. Но при этом следует избегать причесок, украшенных объемными тяжелыми прядями возле челюсти и скул.К каре не подходит длинная густая челка, еще больше увеличивающая ширину лица и утяжеляющая подбородок. В этом случае противопоказаны любые симметричные прически с зачесанными назад волосами. Девушкам с такой формой следует избегать стрижек, в которых длина волос равна линии подбородка, и тех коротких стрижек, которые полностью открывают лицо. Но мало знать какая стрижка подходит квадратному лицу . Женщинам с такой фигурой стоит помнить, что даже очки для него нужно покупать, которые придадут выигрышную нотку прямоугольным линиям, нуждающимся в должном смягчении.Поэтому при выборе правильных очков и оправ важно учитывать следующие моменты:

Подходящие очки для квадратного лица

Подходящие стрижки для квадратного лица определяются их сочетаемостью с его основными чертами — тяжелым подбородком и скулы. Пучок или неправильная короткая стрижка эти недостатки только подчеркивают. Но многие прически очень удачно сглаживают остроту углов. Для этого стрижка должна иметь длину, превышающую линию подбородка, а макушка должна быть максимально высокой.С помощью небольшого начеса, сушки феном, укладки креативный парикмахер, не боящийся экспериментов, сделает укладку, которая визуально приблизит форму лица к овалу. А с использованием косых линий в прическе он сможет придать внешнему виду мягкость, яркие акценты и романтическую изюминку, мастерски избежать прямых, резких, угловатых форм. Это добавит гладкости всем линиям. Да и средние стрижки для квадратного лица тоже способны деликатно визуально вытянуть лицо.

Чтобы избежать прямых линий на волосах, достаточно просто завить кончики волос щеткой сразу после мытья при сушке феном. Если волосы длинные, которые во все времена считались олицетворением женственности, и останутся такими, то для квадратной формы они еще и настоящая находка, способная скрасить явные недостатки внешности.

Длинные волосы тоже украсят квадратное лицо, если их не оставить прямыми, а завить волнами.

Струящиеся локоны способны вытянуть не только овал лица, но даже весь силуэт, что также придаст образу своей обладательницы изысканности.Поэтому не стоит торопиться делать короткую стрижку. Ведь длинные стрижки для квадратного лица — очень удобный способ смягчить его овал.

В этом случае уместно будет сделать химическую завивку, но не с мелкими локонами, способными придать объем параметрам и без того объемного лица. С такими данными достаточно сделать мокрую укладку или волны. Прямые волосы нужно просто завить или расчесать. Хотя на ступенчатую стрижку эти правила не распространяются.

В общем, наблюдаем, доверяем волосы хорошему мастеру — и результат всех порадует!

Фото

Анджелина Джоли

Природа наделила каждую женщину индивидуальными очертаниями лица и фигуры.У одних от рождения рыжие и вьющиеся локоны, у других прямые и темные волосы. Чтобы подчеркнуть красоту того или иного типа, были придуманы самые разнообразные стрижки, начиная от обычного боба и заканчивая выбритыми висками. Стрижки для квадратного лица отличаются отсутствием резких границ и часто имеют асимметричную челку. Женщинам с резкими и угловатыми чертами лица далеко не всем подходят прически и укладки, но не стоит отчаиваться. Ведь модные тенденции каждый год привносят в нашу жизнь совершенно новые и оригинальные прически.

БЫСТРАЯ НАВИГАЦИЯ ПО СТАТЬЯМ

Противопоказания

Само по себе квадратное лицо считается слегка грубым и отдаленно напоминает мужские черты. Однако с помощью грамотно подобранной стрижки можно придать ей округлость и женственность.

Самые популярные варианты – длинные локоны, пышная укладка, а также асимметричные линии.

Как и любая другая форма лица, квадратный тип имеет свои противопоказания:

  • Отказ от коротких стрижек.Но если вы предпочитаете мужской стиль и чувствуете себя комфортно с мальчишеской стрижкой, добавьте асимметричную челку и выбритые бока. Таким образом, вы немного приподнимете границы прически и зрительно вытянете лицо.
  • Укладка не должна иметь прямых и симметричных линий.
  • Длинная челка визуально утяжеляет лицо.

Воспользовавшись советами парикмахеров, вы сможете подобрать идеальную укладку под свои предпочтения и тип лица.

Подходящие стрижки

Для квадратного лица лучше всего подходят объемные и высокие укладки, которые зрительно вытягивают форму.Также парикмахеры советуют обратить внимание на длинные крупные локоны, свободно ниспадающие на лицо.

Каскад. С помощью этой прически вы зрительно удлините лицо и придадите ему мягкие линии. Начинать градуировку лучше всего выше линии скул, чтобы прическа выглядела более объемной. Наряду с каскадом хорошо смотрится и прямая профилированная челка.

Каре Подходит для уверенных в себе женщин и девушек. Пряди на затылке должны быть короче, а удлинение начинать от подбородка.Такая креативная укладка смягчит черты «каре» и придаст ему очаровательную округлость.

– это отличные варианты для придания образу женственности. Дополнить этот образ можно боковой асимметричной челкой.

Для проблемного лица лучший способ скрыть остроту асимметричные стрижки на бок. С их помощью у вас получится образ романтичной и обаятельной натуры.

Еще один вариант прически крупные локоны на длинные волосы.Они зрительно удлиняют силуэт и округляют лицо.

Методы укладки

При укладке взять на вооружение советы стилистов:

  • Если у вас стрижка каскад, пряди необходимо подкручивать наружу.
  • Волосы в каре не должны быть слишком гладкими, главное правило такой стрижки – объем.
  • Пряди в коротких стрижках должны быть взлохмачены и подняты вверх.

большие и романтичные локоны .Если вы обладательница длинных волос и квадратного лица, то лучшим вариантом будет накрутить локоны на плойку или бигуди и зафиксировать их в хаотичном беспорядке.

Главное правило для типа «квадрат» — отсутствие прямых и плавных линий. Таким образом, чем пышнее и небрежнее будут выглядеть ваши локоны, тем легче будет скрыть угловатые и острые черты лица.

Как правильно накручивать локоны рассказывается в видео ниже.

Для обладательниц каре хорошей укладкой считается приподнятых на макушке прядей, создающих таким образом объем.Для начала тщательно расчешите волосы и нанесите на пряди пенку. Затем с помощью фена и тонкой расчески уложите волосы в прическу.

Еще один вариант укладки для квадратного лица – пышный и небрежный пучок сверху. Расчешите волосы у корней и закрепите на макушке шпильками.

Подходит обладательницам средних волос. Нанесите пенку на пряди и с помощью плойки накрутите крупные локоны. Так как квадратная форма требует объема, закалывать локоны не обязательно.

Асимметричные стрижки для квадратного лица позволяют экспериментировать с прической. Расчешите волосы и с помощью фена уложите одну сторону волос. на сторону , а вторую сложите вперед, как показано на фото. Асимметричными линиями волос вы скроете острые черты лица, придав ему округлость и шарм.

Некоторым женщинам подходят прямые и объемные прически . Создайте объем у корней и сбрызните лаком.Таким образом, вы зрительно удлините лицо, а закинутые назад пряди на скулы придадут вам долю загадочности.

Как было сказано выше, не все прически подходят одной и той же девушке. Так что не бойтесь пробовать что-то новое и интересное. Стрижки для квадратного лица позволяют экспериментировать с цветом, формой и укладкой волос.

Отличная идея при выборе новой прически — посмотреть, какие прически носят некоторые знаменитости с похожей на вас формой лица.К тому же не все известные дамы имеют овальное лицо, но, тем не менее, это не мешает им сногсшибательно выглядеть на всех светских мероприятиях, и не только.

С ними работают настоящие профи парикмахерского искусства, и мы можем взять пару идей себе.

Сегодня речь пойдет о квадратной форме лица. А самые яркие ее представители – это Анджелина Джоуль, Пэрис Хитон и Оливия Уайлд.

Сомневаетесь, что у вас лицо именно такой формы, проверьте в нашей предыдущей статье.

Если вы уверены на 100%, то вам повезло.Ведь именно девушки с такими сильными чертами лица считаются самыми сексуальными. Девушке с квадратной формой лица подойдет множество вариантов причесок и укладок. Но есть и табу. Для начала разберемся с запретами, чтобы не совершить роковых ошибок.

Ниже приведена иллюстрация квадратного лица с правильной и неправильной прической. Разницу чувствуешь, да?

Каких причесок вы хотели бы избежать?

Всегда помните, черты вашего лица уже имеют четкие выразительные линии.И прическа не должна их усиливать, а также зрительно расширять или сужать лицо. То есть мы говорим «нет» прическам с геометрическими четкими линиями.

  • Короткая прямая челка
  • Боб с одним подбородком
  • Избегайте волос до подбородка
  • Короткие стрижки пикси допустимы только с нежными прядями, которые будут обрамлять лицо, при этом добавляя нежности и женственности.

Идеальные прически для вас:

Косая стрижка, удлиненный или обычный боб

Именно боб поможет подчеркнуть скулы.Это визуально уравновесит лицо, сделав акцент на средней части лица. Еще один плюс такой стрижки в том, что ее можно подкручивать. С помощью световых волн можно создать романтичный женственный образ для торжественного события.

Взрыв

Тебе нравится челка? Ваш идеальный вариант: челка до бровей, желательно, чтобы она была профилированной. Второй вариант – мягкая челка на бок.

Длина

Длинные волосы можно романтизировать с помощью нежных локонов. Неважно, как вы добьетесь этого результата, с помощью плойки, бигуди или утюжка. Главное, чтобы волны были нежными и мягкими, чтобы зрительно сгладить острые углы ваших скул.

Градуированные слои

Вы можете смягчить линии подбородка, уложив волосы близко к лицу.Это не значит, что вы должны прятаться за волосами. Лучший способ показать красоту своего лица, не акцентируя внимание на квадратной форме, — постричь волосы слоями, начиная с самых коротких прядей от линии подбородка. А выделить пряди можно с помощью геля для укладки.

Короткая стрижка до и после

Мастер по прическам Джереми Дэвис-Барбала покажет вам, как сделать правильную стрижку для квадратного лица.

Усиленный ангиогенез при экс-плеоморфной аденоме карциномы слюнных протоков

Резюме

Карцинома слюнных протоков (SDC) морфологически сходна с раком молочной железы, но сообщается о гиперэкспрессии HER2.Что касается характера начала заболевания, SDC может возникать из de novo или карциномы экс-плеоморфной аденомы (Ca-ex-PA). Недавно сообщалось о множественных молекулярных профилях SDC, а также рака молочной железы со значительными различиями в экспрессии HER2 между Ca-ex-PA и de novo . Мы оценили различия в экспрессии генов между классификациями начала. Мы провели иммуногистохимический анализ и HER2-DISH для 23 пациентов и классифицировали SDC на три подтипа следующим образом: «HER2-позитивный» (HER2+/любой АР), «люминальный-АР» (HER2-/АР+) и «базальноподобный». (HER2-/AR-).Мы оценили уровни экспрессии 84 функциональных генов у 19 пациентов с помощью массива qRT-PCR. Десять случаев были классифицированы как HER2-положительные, семь случаев как Luminal-AR и шесть случаев как Basal-подобные. Паттерн экспрессии генов в целом соответствовал соответствующей классификации иммунного окрашивания. Уровни экспрессии VEGFA, ERBB2(HER2), IGF1R, RB1 и XBP1 были выше, тогда как уровни SLIT2 и PTEN были ниже в Ca-ex-PA, чем в de novo . Функции этих генов были сконцентрированы в ангиогенезе и сигнальном пути AKT/PI3K (критерий Фишера: значение p = 0.025 и 0,004 соответственно). Множественные методы машинного обучения, OPLS-DA, LASSO и RandomForest, также показывают, что VEGFA может быть кандидатом на характерные различия между Ca-ex-PA и de novo . В заключение, сигнальный путь AKT/PI3K, ведущий к ангиогенезу, был гиперактивирован во всех SDC, особенно в тех, которые классифицируются как Ca-ex-PA. VEGFA значительно сверхэкспрессировался в Ca-ex-PA, что может быть решающим фактором злокачественной конверсии в SDC.

Ключевые слова: карцинома слюнных протоков, эксплеоморфная аденома, VEGFA, HER2, машинное обучение ).Недавно гистологическое сходство SDC с раком молочной железы привело к изучению экспрессии HER2 (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека, также известный как ERBB2) (3). Сверхэкспрессия или амплификация HER2 наблюдается у 15–20% пациентов с инвазивным раком молочной железы и считается неблагоприятным прогностическим фактором (4). Сильное иммуногистохимическое окрашивание белка HER2 также было выявлено в 25–92% случаев SDC (5). Эти результаты подчеркивают сходство между SDC и раком молочной железы не только в отношении общей морфологии, но также в отношении иммунофенотипа и профиля экспрессии генов.Более того, несколько исследователей сообщили, что схемы лечения, включающие использование антагонистов HER2, приводят к различным клиническим преимуществам у пациентов с HER2-положительными SDC, хотя эти протоколы не обязательно эффективны для всех пациентов с SDC (6–11). Эти результаты указывают на то, что понятие «SDC», как и понятие рака молочной железы, следует рассматривать не как отдельное заболевание, а как совокупность гетерогенных образований с различными характеристиками. Основываясь на молекулярно-биологическом профиле, рак молочной железы можно разделить на несколько подтипов, и для каждого подтипа показано индивидуальное лечение.На практике анти-HER2-антитела уже применялись для лечения HER2-положительного рака молочной железы, при этом клинические преимущества наблюдались в метастатических и адъювантных условиях (12, 13). Ожидается, что и в SDC индивидуальный выбор лечения будет основываться на стратификации (14, 15). 11 , 16), в настоящее время нет доступной стратификации для индивидуального выбора лечения и нет единого мнения относительно стандартного лечения или протокола.Для разработки терапевтических методов с клиническим применением необходимо дальнейшее понимание онкогенеза SDC.

Кроме того, хорошо известно, что SDC, как и другие виды рака слюнных желез, может возникать de novo или как злокачественный компонент карциномы экс-плеоморфной аденомы (Ca-ex-PA) (17). По этой причине мы сосредоточимся на взаимосвязи между биологическим профилем и характером возникновения ( de novo или Ca-ex-PA) SDC, основываясь на гипотезе о том, что SDC имеют разные биологические профили в зависимости от того, возникают ли они de novo или Са-экс-ПА.Это исследование направлено на уточнение и изучение этиологии и механизма возникновения SDC. Мы изучили их профили экспрессии генов и иммуногистологию и сравнили их между Ca-ex-PA и de novo , а также среди классификаций, основанных на их иммуногистологических профилях.

В частности, мы оценили следующее;

  1. Классификация на подтипы на основе статуса иммунного окрашивания следующая: «HER2-позитивный» (HER2+/любой АР), «люминальный-АР» (HER2-/АР+) и «базальноподобный» (HER2-/АР+). -), (классификация Ди Пальмы) (18).

  2. Связь между классификацией Ди Пальма и экспрессией генов.

  3. Связь между классификацией начала ( de novo против Ca-ex-PA) и классификацией Di Palma.

  4. Связь между классификацией начала ( de novo против Ca-ex-PA) и уровнями экспрессии генов с использованием двухгруппового сравнительного теста и нескольких методов машинного обучения.

Материалы и методы

Отбор пациентов и гистологический обзор

Мы ретроспективно проанализировали 23 пациента с нелеченными SDC, которые перенесли операцию в качестве основного лечения в Университетской больнице Хоккайдо, Япония, в период с 1991 по 2015 год.Было подтверждено, что все опухоли были точно диагностированы двумя экспертами-патологами (TS и KH) в соответствии со строгими гистоморфологическими критериями SDC (2). Мы провели гистологический обзор многоступенчатых срезов всей опухоли в каждом случае, чтобы классифицировать SDC на группу Ca-ex-PA и de novo в соответствии с действующей классификацией ВОЗ. Всем пациентам проводилось хирургическое лечение в качестве основного лечения, и большинство из них подвергалось послеоперационному облучению и/или химиотерапии.

Тканевый микрочип

Блоки тканевого микрочипа были сконструированы с использованием ручного тканевого микрочипа (JF-4; Sakura Finetek Japan, Токио, Япония) с иглой диаметром 1,5 мм. Готовые блоки нарезали на срезы толщиной 4 мм и помещали на предметные стекла. Для проверки гистопатологического диагноза и адекватности взятия образцов ткани срез каждого микрочипа окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали два опытных патологоанатома (Т.С. и К.Х.).

Иммуногистохимия

Для иммуногистохимии (ИГХ) использовалась система обнаружения на основе полимера с выделением антигена при нагревании.Для выявления реакций антиген-антитело применяли диаминобензидин. Для всех условий использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли. ИГХ для HER2 (4B5, Ready-To-Use, Ventana) и AR (AR27, разведение 1:50, Leica) проводили в соответствии с рекомендациями соответствующих производителей.

HER2/CEN17 Двухцветный

in situ Гибридизация

Двухцветный in situ Анализ гибридизации (DISH) с использованием системы Benchmark ULTRA (Ventana Medical Systems, CA) был проведен для всех 23 случаев SDC.Микроматрицу опухолевой ткани толщиной 4 мкм, залитую парафином, помещали на предметное стекло и подвергали DISH. Амплификацию HER2 проводили в соответствии с инструкциями производителя с использованием DISH HER2 PharmDx (Dako, Glostrup, Дания). Были изображены и подсчитаны передача сигналов HER2 (черный сигнал) и центромера хромосомы 17 (CEN17) (красный сигнал) для расчета отношения общего количества сигналов HER2 к общему количеству сигналов CEN17.

Система подсчета очков для классификации иммуноокрашивания

Для HER2 использовалась следующая система подсчета баллов ASCO/CAP: Отрицательный результат, отсутствие окрашивания мембран или окрашивание <10% клеток; 1+, неполное окрашивание мембран >10% клеток; 2+, >10% клеток со слабым или умеренным полным окрашиванием мембраны; и 3+, сильное и полное окрашивание мембран в> 30% клеток (19).Случаи считались HER2-позитивными, если окрашивание HER2 оценивалось как 3+ или 2+ с амплификацией гена HER2, как определено гибридизацией in situ.

Уровень экспрессии AR полуколичественно подсчитывали каждые 10 процентов. Ядерное окрашивание оценивали как положительное. Что касается оценки AR, мы считали ядерную позитивность ≥1% положительной в соответствии с ASCO/CAP 2013. Классификация

на подтипы, основанные на статусе иммуноокрашивания (классификация Ди Пальма).

В соответствии с классификацией, предложенной Di Palma et al.мы классифицировали 23 случая с SDC на три подтипа следующим образом: «HER2-позитивный» (HER2+/любой АР), «люминальный-АР» (HER2-/АР+) и «базалоподобный» (HER2-/АР- ) (18).

ПЦР-матрица для экспрессии генов

RT2 Profiler ПЦР-матрицы ® — это инструменты для анализа экспрессии сфокусированной панели генов. Каждая ПЦР-матрица на 96-луночном планшете включает анализы праймеров SYBR ® , оптимизированных для использования в зеленых условиях, для тщательно изученной панели релевантных генов, связанных с путями или заболеваниями, одновременно в однородных условиях циклирования.Тотальную РНК выделяли с использованием набора FFPE (QIAGEN, #217504). кДНК синтезировали с использованием RT2 SYBR Green ROX qPCR MasterMix (QIAGEN, № 330522). Четыре из 23 образцов были исключены из-за низкого качества РНК. Для проведения реакции в соответствии с инструкциями производителя использовали ПЦР-матрицу для рака молочной железы человека RT 2 Profiler™ (QIAGEN, PAHS-131ZC-12). Амплификацию и анализ в реальном времени проводили с помощью системы ПЦР в реальном времени StepOnePlusTM (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).Уровни транскриптов нормализовали относительно уровней РНК GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Относительные уровни экспрессии мРНК рассчитывали в соответствии со сравнительным методом Ct (ΔΔCt). Мы исключили шесть генов, включая ADAM23 (домен металлопептидазы ADAM 23), BIRC5 (бакуловирусный повтор IAP, содержащий 5), BRCA2 (рак молочной железы 2, раннее начало), CCNA1 (циклин A1), 4RB. (рецептор ретиноевой кислоты, бета) и TWIST1 [гомолог 1 Twist (дрозофила)], поскольку более половины значений отсутствовали.Функция каждого гена указана в документе, включенном в комплект PCR Array (, таблица S1 ). Все планки погрешностей представляют собой стандартное значение ошибки для биологических повторов, деленное на квадратный корень размера выборки (SEM). Там, где проводились технические повторы, эти значения усреднялись, чтобы получить одно значение для каждого биологического повтора, и впоследствии все данные показаны как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Взаимосвязь между классификацией начала (

de novo и Ca-ex-PA) и экспрессией генов с помощью теста сравнения двух групп и нескольких методов машинного обучения

Для сравнения профилей экспрессии генов между Ca-ex-PA и de novo мы провели сравнительный тест в двух группах по 78 генам для 19 случаев.Впоследствии мы искали характерные паттерны экспрессии генов между классификациями начала, используя несколько методов машинного обучения; Ортогональные проекции для дискриминантного анализа скрытых структур (OPLS-DA), LASSO и RandomForest (RF).

OPLS-DA — это контролируемый метод машинного обучения, в котором используется линейная многомерная дискриминантная модель с последующей проекцией прогнозируемых переменных и наблюдаемых переменных в новое пространство (20–22). OPLS-DA может прояснить разницу между двумя группами многомерных данных.Практически, создав главный компонент, который максимизирует расстояние между центроидами двух групп, и количественно определив вес главного компонента как важность фактора, влияющего на классификацию (VIP: переменное влияние на проекцию), мы можем прояснить характерные различия между две группы интерпретируемым образом (21, 23–25). Кроме того, этот метод может избежать проблем мультиколлинеарности, которые часто можно предположить из-за большого количества генов по сравнению с образцами в нашем исследовании.Мы выполнили OPLS-DA с 6-кратной перекрестной проверкой и 10 000 перестановок, чтобы изучить важность генов в качестве классификатора для классификации начала и прояснить механизм возникновения заболевания. Первый главный компонент переменной значимости в проекции (VIP) со значением выше 1,5 принимается как значимое значение для классификации, предполагая гены, характеризующие Ca-ex-PA или de novo .

LASSO — это метод логистического регрессионного анализа с регуляризацией L1 для повышения точности прогнозирования и интерпретируемости создаваемой им статистической модели (26).Он устанавливает коэффициенты менее значимых переменных равными 0, назначая L1-штраф (лямбда) коэффициентам регрессии, и извлекаются только более значимые переменные. Перекрестная проверка с исключением одного (LOOCV) с методом поиска по сетке используется для определения параметра лямбда для оптимизации области под кривой ROC (AUC).

RF — это ансамблевый метод обучения для классификации или регрессии, который работает путем построения множества деревьев решений во время обучения и вывода режима классов (классификация) или среднего прогноза (регрессия) отдельных деревьев (27).RF может работать с многомерными данными непараметрическим способом, что позволяет нам оценивать интерактивные и нелинейные (регрессионные) эффекты. Недавно было обнаружено, что выбор признаков на основе классификатора случайного леса обеспечивает многомерные оценки важности признаков, которые являются относительно эффективными и успешно применяются к многомерным данным, полученным из микрочипов (28).

Мы провели RF-анализ для классификации начала, чтобы изучить важность гена как классификатора для классификации начала и уточнить механизм, лежащий в основе начала заболевания.В соответствии с настройками по умолчанию пакета R «RandomForest» количество переменных, используемых для каждого дерева решений, было установлено равным восьми. Для построения модели CART были выбраны 13 из 19 образцов, чтобы можно было дублировать. Количество деревьев решений было установлено на уровне 10 000. Этот окончательный прогноз определяется по принципу большинства голосов. Мы приняли MeanDecreaseGini в качестве индекса важности переменной для классификации.

MissForest

Биомедицинские исследования, основанные на высокопроизводительных технологиях, часто сталкиваются с проблемой отсутствия данных.Алгоритмы, обычно используемые при анализе таких крупномасштабных данных, часто зависят от полного набора, особенно для некоторых методов машинного обучения.

Множественное вменение (MI) широко используется для обработки недостающих данных в биомедицинских исследованиях (29). Наиболее распространенные методы множественного вменения, такие как k ближайших соседей для непрерывных данных, насыщенная полиномиальная модель для категориальных данных и многомерное вменение с помощью цепных уравнений для смешанных типов данных, зависят от параметров настройки или спецификации параметрической модели, такой как линейные данные. структура; однако реальные данные не обязательно следуют этим предположениям (30–32).

MissForest — это итеративный метод импутации, основанный на случайном лесу путем усреднения по множеству необрезанных деревьев классификации или регрессии. Характеристики непараметрического и рандомизированного метода в этом алгоритме можно применять к реальным данным без строгих предположений об аспектах распределения данных. На практике также известно, что можно добиться лучшей производительности без настройки параметров.

Мы вписываем отсутствующие значения для наших данных «выражения гена», включая отсутствующие значения, с помощью R-пакета «missForest» (33).Процент отсутствующих значений составил 9,8% (145/1482), что говорит о том, что импутация по методу «missForest» применима с точки зрения качества импутации (34). В соответствии с настройками пакета R «missForest» по умолчанию количество деревьев решений было установлено равным 100, а количество переменных, используемых в каждом дереве решений, было установлено равным восьми. Мы рассчитали частоту ошибок вменения OOB на основе нормализованной среднеквадратичной ошибки и оценили точность дополнения. Значение частоты ошибок OBB приблизилось к 0.483. Затем эти вмененные данные были применены к OPLS-DA, LASSO и RandomForest.

Разделение набора данных для машинного обучения

Методы контролируемого машинного обучения обычно требуют разделения данных на обучающие и тестовые данные. По «правилу 70-30» мы случайным образом разделили данные на 70% для обучения и 30% для теста с R-пакетом «caret». Эти обучающие данные и тестовые данные были затем применены к LASSO.

Статистический анализ

Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения R ver.3.5.1 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия. URL-адрес https://www.R-project.org/.). В этом анализе мы использовали R-пакеты «caret», «glmnet», «pROC», «missForest», «randomForest» и «ranger».

Результаты

Классификация на подтипы иммуноокрашивания на основе статуса (классификация Ди Пальма).

Изображения IHC и DISH показаны в . Для HER2-IHC мы классифицировали 10 случаев (43,5%) как 3+, 5 случаев (21,7%) как 2+, 1 случай (4,3%) как 1+ и 7 случаев (30,4%) как 0. Для HER2- БЛЮДО, девять ящиков (40.9%) оказались положительными, при этом оценка HER2-IHC во всех девяти случаях составила 3+. Только в одном случае показатель HER2-IHC был равен 0, и оценка HER2-DISH была невозможна, поскольку на предметном стекле не наблюдалось сигнала CEN17. Наконец, 10 SDC были оценены как HER2-положительные ().

Иммуногистохимическое окрашивание HER2 и AR и двухцветная гибридизация in situ (DISH) HER2/CEN17. (A) HER2 (увеличение, 200×), (B) AR (увеличение, 200×) и (C) HER2/CEN17-DISH (увеличение, 200×).

Стол 1

Перекрестный стол HER2-IHC-DISH.

Her2-IHC
Her2-Bload 3+ 2+ 1+ 0
положительный 9 0 0 0
отрицательный 1 5 1 6

Пропорция AR-позитивных клеток показала бимодальное распределение, а средний количественный процент AR-положительных клеток составил 2,801%0, 3-й квантиль: 85,0, IQR: 65,0). Семнадцать из 23 случаев (73,9%) считались AR-позитивными (4).

Таблица 2

3 AR-IHCC
Her2-Score положительный отрицательный
положительный 10 0
отрицательный 7 6

В текущем исследовании 10 случаев были классифицированы как HER2-положительные, семь случаев как Luminal-AR и шесть случаев как базальноподобные ().

Таблица 3

Классификация Ди Пальмы.

Дела 9075
90 751 HER2 AR
HER2-положительного + +/- 10
люминал-AR + 7 7 9
Базальный 9

6

Отношения между классификацией Di Palma и выражением генов

Мы оценили выражение 78 генов на 19 случаев, в том числе 10 HER2-положительные, 5 Luminal-AR и 4 Basal-подобные случаи с использованием количественного массива RT-PCR ().

Гистограммы экспрессии генов при карциномах слюнных протоков (19 образцов × 78 генов). В общей группе SDC VEGFA, AKT1, MMP2, MAPK3, MMP9 и IGF1R были относительно сверхэкспрессированы, в то время как SLIT2 был подавлен. Планка погрешности означает ±2×SEM (стандартная ошибка среднего).

Чтобы оценить, отражает ли классификация Di Palma статус экспрессии генов, мы оценили 14 маркерных генов классификации рака, соответствующих статусу иммунного окрашивания: «HER2-положительный рак»: ERBB2 и GRB7 (белок 7, связанный с рецептором фактора роста), «Рак Luminal-AR»: AR , ESR1 (рецептор эстрогена 1), FOXA1 (Forkhead box A1), GATA3 (GATA-связывающий белок 3), KRT8 (кератин 8), KRT814 (Кератин 18), SLC39A6 (семейство носителей растворенного вещества 39), TFF3 (фактор трилистника 3) и XBP1 (X-box-связывающий белок 1), и «базальноподобный рак»: EGFR , КРТ5 (Кератин 5) и НОТЧ2 (Нотч 1).Среди этих генов девять генов ( ERBB2 , GRB7 , AR , ESR1 , GATA3 , KRT18 , KRT18 , SLC39A6 , и TFF3) были обнаружены, что имеют существенные различия в выражении в соответствии с Di Palma, при этом паттерны экспрессии генов демонстрируют значительные различия, которые в целом соответствуют их маркерам для классификации иммунного окрашивания (). За исключением этих 14 маркерных генов классификации рака, были значительные различия в экспрессии трех генов: GLI1 (цинковый палец 1 семейства GLI), KRT19 (кератин 19) и VEGFA .

Таблица 4

Экспрессия гена «маркер подтипа» по классификации Di Palma.

9076 90 989 Базальный типа
Маркер классификации Статистический тест p-значение в подтипах Post-hoc p-значение в H против B p-значение в L5 против B 9077 Значительный статус выражения гена
99

HER2 Oneway-Anova 7 <0001 TukeyHSD от 0,003 0,822 от 0,002 H> B, H> L
GRB7 Oneway-дисперсионный 0,011 TukeyHSD 0,049 0,961 0,027 H> B, H> L
люминал-AR
AR Oneway-дисперсионный 0.022 TukeyHSD 0,018 0,152 0,789 H> B
ESR1 Oneway-дисперсионный 0,040 TukeyHSD 0,568 0,041 0,107 L> B
Soxa1 Kruskal-Wallis 0.302 6
Gata3 Oneway-Anova 0.042 TukeyHSD 0,422 0,037 0,154 л> Б
KRT8 OneWay-ANOVA 0,087
KRT18 Oneway-Anova 0.013 TUKEYHSD 0.065 0.065 0.325 0.325 7 L> B
SLC39A6 Oneway-Anova 0.019 TukeyHSD 0,188 0,015 0,162 л> Б
TFF3 OneWay-ANOVA 0,036 TukeyHSD 0,690 0,043 0,076 L> B
XBP1 Oneway-Anova 0.023 TUKEYHSD 0.083 0.083 0.985 0.040 H> B, H> L
EGFR Крускала-Уоллиса 0,433
KRT5 0.523 0.523 9 9
Notch2 Kruskal-Wallis 0.225

Отношения между началом классификации (

De Novo против Ca-Ex-PA) и ди-Пальма классификация

из 14 случаев Ca-Ex-Pa, девять были классифицированы как «HER2-положительные», три — как «люминальные-AR» и два — как «базалоподобные». С другой стороны, из девяти случаев de novo SDC один был классифицирован как «HER2-положительный», четыре — как «Luminal-AR» и четыре — как «базальноподобный». Сравнение de novo и Ca-ex-PA выявило более частую HER2-позитивность в Ca-ex-PA, чем у de novo (точный критерий Фишера: p-значение = 0.029) ().

Таблица 5

Сравнение классификации Di Palma и классификации начала заболевания.

Ca-Ex-PA Type De Novo Type
9

9 9077 9

9 1
Luminal-Ar 3 4
Базальноподобные 2 4

Связь между классификацией начала (

de novo vs.Ca-ex-PA) и экспрессия генов с использованием теста сравнения двух групп и нескольких методов машинного обучения

1. Тест сравнения двух групп

Что касается классификации начала, семь генов показали значительные различия в экспрессии генов между Ca-ex- PA и de novo : VEGFA , ERBB2 , IGF1R , IGF1R (рецептор фактора роста инсулинового роста 1), RB1 (Retinoblastoma 1), XBP1 , SLIT2 и PTEN (фосфатаза и гомолог тензина).В SDC типа Ca-ex-PA наблюдалось повышение экспрессии генов VEGFA , ERBB2 , IGF1R , RB1 и XBP1 , в то время как экспрессия PTEN2 и снижалась. Анализ по генетической функции показал, что значительные различия в экспрессии генов между Ca-ex-PA и de novo были сконцентрированы в генах, связанных с ангиогенезом и сигнальным путем AKT/PI3K (критерий Фишера: значение p = 0,025 и 0.004 соответственно) (, ).

Таблица 6

Экспрессия генов по классификации начала.

Символ гена Метод статистического тестирования Значение p в подтипе Особенности паттернов экспрессии генов
HER2 студенческий T 0,030 Ca-ex-PA > de novo
IGF1R Т студенческий 0.043 Ca-ex-PA > de novo
ПТЭН студенческий Т 0,044 de novo > Ca-ex-PA
RB1 студенческий T 0,026 Ca-ex-PA > de novo
SLIT2 студенческий T 0,046 de novo > Ca-ex-PA
VEGFA студенческий Т 0.034 Ca-ex-PA > de novo
XBP1 студенческий T 0,037 Ca-ex-PA > de novo

Диаграмма взаимосвязи между генами и их генетическими функциями. Соответствие между каждым геном и его функцией показано связями между линиями. В разделе «Маркеры классификации рака» 17 генов классификационных маркеров были классифицированы в соответствии с классификацией Ди Пальмы.Закрашенные «желтые» блики представляют значительные различия в экспрессии генов по классификации иммунного окрашивания. Закрашенные «фиолетовые» блики представляют значительные различия в экспрессии генов по классификации начала (Ca-ex-PA > de novo ). Закрашенные «розовые» блики представляют значительные различия в экспрессии генов по классификации начала ( de novo > Ca-ex-PA). Анализ по генетической функции показал, что значительные различия в экспрессии между Ca-ex-PA и de novo были сосредоточены в генах, связанных с ангиогенезом и сигнальным путем AKT/PI3K (критерий Фишера: p-значение = 0.025 и 0,004 соответственно).

2. Ортогональные проекции на дискриминантный анализ скрытых структур

После 10 000 перестановочных тестов значение pQ2 составило 0,0352, что позволяет предположить, что модель OPLS-DA не была переобучена, и две группы имели значительные различия с точки зрения OPLS- Карты показателей DA (спектральное разделение) (, рисунок S1, ). В этой модели OPLS-DA 14 были найдены 14 генов VIP> 1.5, заказанные следующим образом: VEGFA , XBP1 , PTEN , Pycard , TFF3 , MKI67 , RASSF1 , TP73 , SLIT2 , CDK2 , ERBB2 , ESR2 , MMP2 и BRCA1 . VEGFA и PTEN имели высокие значения VIP, которые считались связанными с ангиогенезом ( Рисунок S2 ).

3. Lasso

Девять генов добывали как достаточно значимые, в следующем порядке: MKI67 , AR , GSTP1 , CTSD , PTEN , ID1 , SFRP1 , CSF1 и КРТ18 ( рисунок S3 ). Чувствительность, специфичность и AUC были равны 0.6667, 1,0000 и 0,8333 соответственно.

4. RandomForest

NOTCh2, CDKN1C, ID1, KRT8, RB1 и VEGFA имели высокие значения MeanDecreaseGini для классификации начала, большинство из которых считается связанными с ангиогенезом ( Рисунок S4 ). Мы рассчитали показатель Out-Of-Bag (OOB) для оценки ошибки обобщения, значение которой сходилось примерно к 0,368 для классификации начала.

Обсуждение

Рак слюнных протоков (SDC) был впервые описан как морфологически сходный с раком молочной железы в 1968 г. (1).SDC представляет собой быстро растущее образование с потенциалом местного рецидива и метастазов в шею и/или отдаленных метастазов. В настоящее время стандартом лечения SDC является полная хирургическая резекция с диссекцией лимфатических узлов и адъювантной лучевой терапией. Однако результаты стандартной терапии продолжают быть неутешительными. Более 50% пациентов умирают от болезни в течение 3–5 лет, несмотря на агрессивную хирургическую резекцию и лучевую терапию, а общая 5-летняя выживаемость составляет 42–55% (35–39). Более того, терапевтические возможности для пациентов с далеко зашедшим нерезектабельным первичным, рецидивирующим или метастатическим заболеванием особенно ограничены (40).

При раке молочной железы уже разработаны терапевтические стратегии, основанные на клинико-патологических и молекулярно-биологических данных, которые способствовали нашему пониманию механизмов развития заболевания и применялись в клинических условиях. С другой стороны, при SDC, хотя новая классификация, основанная на иммунных профилях, была предложена Di Palma et al. (18), на сегодняшний день было проведено мало исследований о том, отражает ли классификация молекулярно-биологический статус.

Впоследствии мы сосредоточились на классификации начала и проанализировали различия в экспрессии генов между Ca-ex-PA и de novo SDC. Как показано на рисунке, для двух групп наблюдались разные профили генов, при этом семь генов демонстрировали значительные различия в экспрессии генов. Интересно, что их функции, как правило, связаны с ангиогенезом и сигнальным путем AKT/PI3K.

Классификация Di Palma представляет профили экспрессии генов, а подтипы имеют разные профили экспрессии генов аналогичны нашим результатам (2, 14, 41–46).Таким образом, считается, что пациенты в этом исследовании представляют собой ту же популяцию, что и в предыдущих статьях.

Мы проверили, может ли классификация Di Palma, основанная на статусе иммунного окрашивания, применяться к профилям экспрессии генов путем сравнения статуса иммунного окрашивания с экспрессией соответствующего гена. Было обнаружено, что среди 14 маркерных генов классификации рака, соответствующих статусу иммунного окрашивания, девять генов демонстрируют значительные различия в экспрессии генов по классификации Ди Пальмы, что позволяет предположить, что иммунное окрашивание надлежащим образом отражает профили экспрессии генов и что каждый подтип основан на классификации Ди Пальма («HER2-положительные », «Luminal-AR» и «Basal-like»), имеет другой профиль экспрессии генов.

Характерные различия между Ca-Ex-PA и

de novo

В текущем исследовании HER2-положительные случаи чаще наблюдались в Ca-ex-PA, чем в de novo (точный критерий Фишера: p -значение = 0,029), что позволяет предположить наличие тенденции к характерным различиям в иммуноокрашивании между двумя типами SDC.

Впоследствии мы искали характерные различия в экспрессии генов между классификациями начала.Во-первых, мы сравнили экспрессию 78 генов для 19 случаев между Ca-ex-PA и de novo с помощью теста сравнения двух групп.

Затем мы хотели выполнить многомерный анализ, чтобы исключить влияние смешанных факторов; однако количество генов, оцененных для числа случаев, было настолько большим, что считалось, что это может привести к проблеме множественной коллинеарности. Поэтому мы применили ряд методов машинного обучения для поиска характерных различий в экспрессии генов между классификациями начала заболевания.

В результате сравнительный тест двух групп и методы машинного обучения показали, что гены, связанные с ангиогенезом, могут быть выделены как кандидаты, демонстрирующие характерные различия между Ca-ex-PA и de novo . В частности, VEGFA, который играет основную роль в ангиогенезе, был выбран в качестве кандидата для объяснения характерных различий между Ca-ex-PA и de novo во всех анализах.

Ангиогенез при карциноме слюнных протоков

В текущем исследовании VEGFA был сверхэкспрессирован в SDC в целом, и особенно в SDC в группе Ca-ex-PA. VEGFA является членом семейства генов VEGF, которые особенно важны для индукции ангиогенеза (47). Сообщалось, что VEGF экспрессируется на высоких уровнях при большинстве видов рака (48) и связан с повышенным риском рецидива, метастазирования и смерти при НМРЛ и ПКР (49–51).

Фаур и др. исследовали, различаются ли опухоли слюнных желез с различной морфологией и эволюцией с точки зрения неоваскуляризации и экспрессии VEGF, а также прогностическую ценность результатов (52).Хирургические образцы (8 PA, 7 опухолей Уортина, 5 базально-клеточных аденом, 6 Ca-ex-PA, 6 мукоэпидермоидных карцином, 5 ацинно-клеточных карцином, 4 аденоидно-кистозных карциномы и 4 аденокарциномы, не указанные иначе) были окрашены иммунной системой. Злокачественные опухоли слюнных желез показали достоверно более высокий уровень экспрессии VEGF по сравнению с доброкачественными опухолями (p = 0,001). Фонсека и др. сообщили об иммуноокрашивании VEGF для 132 опухолей слюнных желез (50 PA, 32 мукоэпидермоидных карциномах, 30 аденокарциномах, не уточненных иначе, и 20 аденоидных кистозных карциномах) и его связи с их гистопатологическим типом (53).Экспрессия VEGF была обнаружена в цитоплазме во всех случаях, что оказалось сверхэкспрессией в злокачественных опухолях по сравнению с PA, что позволяет предположить, что VEGF может быть связан с патогенезом и агрессивностью рака слюнных желез. Фернандес и др. исследовали экспрессию белка VEGF в 66 карциномах слюнных желез и выяснили связь между VEGF и клинико-патологическими параметрами (54). Экспрессия VEGF наблюдалась в 41 опухоли (62%) и коррелировала с метастазированием в лимфатические узлы (p < 0,005), клинической стадией (p < 0,005).02), причинно-специфическая выживаемость (p < 0,01) и локальная безрецидивная выживаемость (p < 0,02). Они предположили, что VEGF может способствовать прогрессированию карцином слюнных желез и, по-видимому, связан с метастазированием шейных лимфоузлов, худшей выживаемостью и плохим местным контролем заболевания. Соарес и др. исследовали ангиогенное переключение во время злокачественной трансформации PA в Ca-ex-PA, включая 10 PA, 8 ранних Ca-ex-PA и 8 продвинутых Ca-ex-Pas, и доказали, что ангиогенез постепенно, но значительно увеличивался от PA до широко инвазивный Ca-ex-Pas (55).Все приведенные выше сообщения позволяют предположить, что VEGF участвует в злокачественной конверсии при раке слюнных желез.

Кроме того, известно, что VEGFA играет ключевую роль в пути PI3K/AKT (49) (). Активация PI3K происходит посредством мутации RAS , потери PTEN или повышенной экспрессии рецепторов факторов роста, таких как ERBB2 , EGFR , IGF1R и VEGFA . С другой стороны, активация пути PI3K/AKT в опухолевых клетках может стимулировать секрецию VEGFA как с помощью индуцируемого гипоксией фактора 1 ( HIF-1α ), так и независимого механизма (49).То есть VEGFA сам вызывает автономную пролиферацию через путь AKT/PI3K/VEGFA, который ранее был идентифицирован как «аутокринная сигнальная петля VEGFA» при многих других видах рака (56). В текущем исследовании мы наблюдали высокие уровни экспрессии VEGFA , AKT1 и IGF1R , что указывает на возможность присутствия «аутокринной сигнальной петли VEGFA» в SDC. Кроме того, в Ca-ex-PA SDC уровни экспрессии VEGFA , ERBB2 и IGF1R были повышены, а уровень экспрессии PTEN снижен.Эти результаты позволяют предположить, что путь AKT/PI3K/VEGFA может активироваться более агрессивно в Ca-ex-PA, чем в de novo SDC, и дополнительно способствовать ангиогенезу.

Сигнальный путь ERBB2/VEGFA-AKT-PI3K-VEGFR и аутокринная сигнальная петля VEGFA. VEGFA индуцирует свою автономную пролиферацию через путь AKT/PI3K/VEGFA или путь Ras/Raf/MEK/ERK, идентифицированный как «аутокринная сигнальная петля VEGFA» при многих других видах рака.

Что касается механизма, лежащего в основе ангиогенеза, недавние исследования предоставили огромное понимание фундаментальных аспектов ангиогенеза, что привело к механистической модели ветвления сосудов (57, 58) ().В нормальных условиях покоя базальная мембрана расположена между эндотелиальными клетками (ECs) и пристеночными клетками, что препятствует тому, чтобы резидентные ECs покидали свое положение относительно покрытия пристеночных клеток. ММР, включая ММР2 и ММР9, которые экспрессируются многими типами клеток, включая фибробласты, кератиноциты и ЭК, разрушают базальную мембрану в сотрудничестве с VEGFA во внеклеточном матриксе, способствуя миграции ЭК и генерируя ангиогенез (59). В этом исследовании мы наблюдали высокие уровни экспрессии MMP2 и MMP9 в SDC в целом, что свидетельствует о большей миграции EC во внеклеточный матрикс и стимулировании ангиогенеза.

Принципиальная схема механизма ангиогенеза. (A) Деградация базальной мембраны: ММР, включая ММР2 и ММР9, способствуют деградации базальной мембраны, впоследствии эндотелиальные клетки сосудов могут мигрировать во внеклеточный матрикс. (B) Миграция перицитов во внеклеточный матрикс: петля обратной связи VEGF-NOTCH участвует в селективной трансформации эндотелиальных клеток сосудов в верхушечные клетки или клетки стебля. Постоянное воздействие VEGFA вызывает аномальное ускорение петли обратной связи VEGF-NOTCH. (C) Отрицательный контроль ангиогенеза с помощью системы SLIT2-ROBO4: SLIT2 ингибирует VEGFR2 и NOTCh2 в верхушечных клетках и клетках стебля через ROBO4. SLIT2-ROBO4 играет роль «тормоза» для петли обратной связи VEGF-NOTCH.

Кроме того, ЭК трансформируются в верхушечные клетки и клетки стебля. Клетки кончика приводят к образованию новых отростков и исследуют, подходит ли среда для ангиогенеза, в то время как клетки стебля, прилегающие к клеткам кончика, образуют просвет и поддерживают клетки кончика при удлинении отростков.Обе клетки играют решающую роль в согласии друг с другом. Бентли и др. сообщили о механизме петли обратной связи VEGFR-Dll4 (дельта-подобный канонический лиганд Notch 4)-Notch-VEGFR между верхушечными клетками и стволовыми клетками, которая регулирует отбор верхушечных клеток и стволовых клеток (60). По мере того, как эта петля обратной связи повторяется, стимулируется дифференцировка ECs в верхушечные клетки и клетки стебля, что приводит к гиперваскуляризации. Чтобы регулировать эту петлю обратной связи, SLIT2-ROBO4 (рецептор 4 кольцевого управления) работает как «тормоз», при этом SLIT2 ингибирует VEGFR и NOTCh2 через рецептор ROBO4 на клеточной мембране верхушечных клеток и стволовых клеток (57, 61).В SDC Ca-ex-PA мы наблюдали более высокий уровень экспрессии VEGFA и более низкий уровень экспрессии SLIT2 , что указывает на то, что регуляция петли обратной связи VEGFR-Dll4-Notch-VEGFR с помощью SLIT2/ROBO4 могла быть выходит из-под контроля, что приводит к гиперактивации петли обратной связи. Эти результаты свидетельствуют о том, что неконтролируемый ангиогенез может стимулироваться при SDC, особенно при типе Ca-ex-PA.

Вклад авторов

Окончательные блоки были нарезаны на срезы толщиной 4 мм и помещены на предметные стекла.Для проверки гистопатологического диагноза и адекватности взятия образцов ткани срез каждого микрочипа окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали два эксперта-патолога (TS, KH). Т.С., С.К. и А.Х. задумали исследование и предоставили рекомендации и руководство исследованием. TS, AH, SK, TM, SY и NT собирали и регистрировали данные. TS, KH и YM проверили гистопатологический диагноз. TS и YH сконструировали каждый микрочип и провели иммуноокрашивание и двухцветную гибридизацию in situ .ТС и МС провели qRT-PCR. TS и MS внесли свой вклад в анализ данных. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2020.603717/full#supplementary-material

Дополнительный рисунок 1
OPLS-

Карта оценок DA. Карта оценок OPLS-DA показывает, что две группы были определенно классифицированы OPLS-DA.

Дополнительный рисунок 2

Значение переменной в проекции в OPLS-DA. Четырнадцать генов VIP> 1.5 были найдены, заказанные следующим образом: VEGFA , XBP1 , PTEN , Pycard , TFF3, MKI67 , RASSF1 , TP73 , SLIT2 , CDK2 , CDK2 , ERBB2 , ESR2 , MMP2 и BRCA1 .

Дополнительный рисунок 3

Важность переменной по модели логистической регрессии с регуляризацией L1.Девять генов, в следующем порядке: MKI67 , AR , GSTP1 , GSTP1 , CTSD , PTEN , ID1 , SFRP1 , CSF1 и KRT18 , имели ненулевые коэффициенты , что может быть достаточно значимым в этой модели.

Дополнительный рисунок 4

MeanDecreaseGini в RandomForest. NOTCh2 , CDKN1C , ID1 , KRT8 , RB1 и VEGFA имели высокие значения MeanDecreaseGini для классификации начала.

Gale Apps — Технические трудности

Технические трудности

Приложение, к которому вы пытаетесь получить доступ, в настоящее время недоступно. Приносим свои извинения за доставленные неудобства. Повторите попытку через несколько секунд.

Если проблемы с доступом сохраняются, обратитесь за помощью в наш отдел технической поддержки по телефону 1-800-877-4253. Еще раз спасибо, что выбрали Gale, обучающую компанию Cengage.

org.springframework.remoting.RemoteAccessException: невозможно получить доступ к удаленной службе [[email protected]]; вложенным исключением является Ice.UnknownException unknown = «java.lang.IndexOutOfBoundsException: индекс 0 выходит за границы для длины 0 в java.base/jdk.internal.util.Preconditions.outOfBounds(Preconditions.ява: 64) в java.base/jdk.internal.util.Preconditions.outOfBoundsCheckIndex(Preconditions.java:70) в java.base/jdk.internal.util.Preconditions.checkIndex(Preconditions.java:248) в java.base/java.util.Objects.checkIndex(Objects.java:372) в java.base/java.util.ArrayList.get(ArrayList.java:458) на com.gale.blis.data.subscription.dao.LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.populateSessionProperties(LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.ява: 60) в com.gale.blis.data.subscription.dao.LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.reQuery(LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.java:53) в com.gale.blis.data.model.session.UserGroupEntitlementsManager.reinitializeUserGroupEntitlements(UserGroupEntitlementsManager.java:30) в com.gale.blis.data.model.session.UserGroupSessionManager.getUserGroupEntitlements(UserGroupSessionManager.java:17) на com.gale.blis.api.authorize.contentmodulefetchers.CrossSearchProductContentModuleFetcher.getProductSubscriptionCriteria(CrossSearchProductContentModuleFetcher.java:244) на com.gale.blis.api.authorize.contentmodulefetchers.CrossSearchProductContentModuleFetcher.getSubscribedCrossSearchProductsForUser(CrossSearchProductContentModuleFetcher.java:71) на com.gale.blis.api.authorize.contentmodulefetchers.CrossSearchProductContentModuleFetcher.getAvailableContentModulesForProduct(CrossSearchProductContentModuleFetcher.java:52) в ком.gale.blis.api.authorize.strategy.productentry.strategy.AbstractProductEntryAuthorizer.getContentModules(AbstractProductEntryAuthorizer.java:130) на com.gale.blis.api.authorize.strategy.productentry.strategy.CrossSearchProductEntryAuthorizer.isAuthorized(CrossSearchProductEntryAuthorizer.java:82) на com.gale.blis.api.authorize.strategy.productentry.strategy.CrossSearchProductEntryAuthorizer.authorizeProductEntry(CrossSearchProductEntryAuthorizer.java:44) в ком.gale.blis.api.authorize.strategy.ProductEntryAuthorizer.authorize(ProductEntryAuthorizer.java:31) в com.gale.blis.api.BLISAuthorizationServiceImpl.authorize_aroundBody0(BLISAuthorizationServiceImpl.java:57) на com.gale.blis.api.BLISAuthorizationServiceImpl.authorize_aroundBody1$advice(BLISAuthorizationServiceImpl.java:61) на com.gale.blis.api.BLISAuthorizationServiceImpl.authorize(BLISAuthorizationServiceImpl.java:1) на com.gale.blis.auth._AuthorizationServiceDisp._iceD_authorize(_AuthorizationServiceDisp.java:141) в com.gale.blis.auth._AuthorizationServiceDisp._iceDispatch(_AuthorizationServiceDisp.java:359) в IceInternal.Incoming.invoke(Incoming.java:209) в Ice.ConnectionI.invokeAll(ConnectionI.java:2800) в Ice.ConnectionI.dispatch(ConnectionI.java:1385) в Ice.ConnectionI.message(ConnectionI.java:1296) в IceInternal.ThreadPool.запустить (ThreadPool.java: 396) в IceInternal.ThreadPool.access$500(ThreadPool.java:7) в IceInternal.ThreadPool$EventHandlerThread.run(ThreadPool.java:765) в java.base/java.lang.Thread.run(Thread.java:834) » org.springframework.remoting.ice.IceClientInterceptor.convertIceAccessException(IceClientInterceptor.java:365) org.springframework.remoting.ice.IceClientInterceptor.вызывать (IceClientInterceptor.java:327) org.springframework.remoting.ice.MonitoringIceProxyFactoryBean.invoke(MonitoringIceProxyFactoryBean.java:71) org.springframework.aop.framework.ReflectiveMethodInvocation.proceed(ReflectiveMethodInvocation.java:186) org.springframework.aop.framework.JdkDynamicAopProxy.invoke(JdkDynamicAopProxy.java:212) com.sun.proxy.$Proxy130.authorize(Неизвестный источник) ком.gale.auth.service.BlisService.getAuthorizationResponse(BlisService.java:61) com.gale.apps.service.impl.MetadataResolverService.resolveMetadata(MetadataResolverService.java:65) com.gale.apps.controllers.DiscoveryController.resolveDocument(DiscoveryController.java:57) com.gale.apps.controllers.DocumentController.redirectToDocument(DocumentController.java:22) jdk.internal.reflect.GeneratedMethodAccessor309.invoke (неизвестный источник) Джава.base/jdk.internal.reflect.DelegatingMethodAccessorImpl.invoke(DelegatingMethodAccessorImpl.java:43) java.base/java.lang.reflect.Method.invoke(Method.java:566) org.springframework.web.method.support.InvocableHandlerMethod.doInvoke(InvocableHandlerMethod.java:215) org.springframework.web.method.support.InvocableHandlerMethod.invokeForRequest(InvocableHandlerMethod.java:142) org.springframework.web.servlet.mvc.method.annotation.ServletInvocableHandlerMethod.invokeAndHandle(ServletInvocableHandlerMethod.java:102) org.springframework.web.servlet.mvc.method.annotation.RequestMappingHandlerAdapter.invokeHandlerMethod (RequestMappingHandlerAdapter.java:895) org.springframework.web.servlet.mvc.method.annotation.RequestMappingHandlerAdapter.handleInternal (RequestMappingHandlerAdapter.java:800) org.springframework.web.servlet.mvc.method.AbstractHandlerMethodAdapter.дескриптор (AbstractHandlerMethodAdapter.java:87) org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doDispatch(DispatcherServlet.java:1038) org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doService(DispatcherServlet.java:942) org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.processRequest(FrameworkServlet.java:998) org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.doGet(FrameworkServlet.java:890) javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:626) org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.service(FrameworkServlet.java:875) javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:733) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:227) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) орг.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:53) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.apache.catalina.filters.HttpHeaderSecurityFilter.doFilter(HttpHeaderSecurityFilter.java:126) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.ява: 189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.servlet.resource.ResourceUrlEncodingFilter.doFilter(ResourceUrlEncodingFilter.java:63) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) орг.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:101) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:101) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.внутреннийDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:101) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.ява: 162) org.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter.doFilter(ErrorPageFilter.java:130) org.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter.access$000(ErrorPageFilter.java:66) org.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter$1.doFilterInternal(ErrorPageFilter.java:105) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) орг.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter.doFilter(ErrorPageFilter.java:123) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.boot.actuate.web.trace.servlet.HttpTraceFilter.doFilterInternal(HttpTraceFilter.java:90) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.RequestContextFilter.doFilterInternal (RequestContextFilter.java: 99) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.FormContentFilter.doFilterInternal (FormContentFilter.java:92) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) орг.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.HiddenHttpMethodFilter.doFilterInternal (HiddenHttpMethodFilter.java:93) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.внутреннийDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.boot.actuate.metrics.web.servlet.WebMvcMetricsFilter.filterAndRecordMetrics(WebMvcMetricsFilter.java:154) org.springframework.boot.actuate.metrics.web.servlet.WebMvcMetricsFilter.filterAndRecordMetrics(WebMvcMetricsFilter.java:122) org.springframework.boot.actuate.metrics.web.servlet.WebMvcMetricsFilter.doFilterInternal(WebMvcMetricsFilter.java:107) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.CharacterEncodingFilter.doFilterInternal (CharacterEncodingFilter.java:200) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.apache.catalina.core.StandardWrapperValve.invoke(StandardWrapperValve.ява: 202) org.apache.catalina.core.StandardContextValve.invoke(StandardContextValve.java:97) org.apache.catalina.authenticator.AuthenticatorBase.invoke(AuthenticatorBase.java:542) org.apache.catalina.core.StandardHostValve.invoke(StandardHostValve.java:143) org.apache.catalina.valves.ErrorReportValve.invoke(ErrorReportValve.java:92) org.apache.catalina.valves.AbstractAccessLogValve.invoke(AbstractAccessLogValve.ява: 687) org.apache.catalina.core.StandardEngineValve.invoke(StandardEngineValve.java:78) org.apache.catalina.connector.CoyoteAdapter.service(CoyoteAdapter.java:357) org.apache.coyote.http11.Http11Processor.service(Http11Processor.java:374) org.apache.coyote.AbstractProcessorLight.process(AbstractProcessorLight.java:65) org.apache.coyote.AbstractProtocol$ConnectionHandler.process(AbstractProtocol.ява: 893) org.apache.tomcat.util.net.NioEndpoint$SocketProcessor.doRun(NioEndpoint.java:1707) org.apache.tomcat.util.net.SocketProcessorBase.run(SocketProcessorBase.java:49) java.base/java.util.concurrent.ThreadPoolExecutor.runWorker(ThreadPoolExecutor.java:1128) java.base/java.util.concurrent.ThreadPoolExecutor$Worker.run(ThreadPoolExecutor.java:628) org.apache.tomcat.util.threads.TaskThread$WrappingRunnable.запустить (TaskThread.java: 61) java.base/java.lang.Thread.run(Thread.java:834)

Интегративный анализ измерений путем выбора дескриптора машинного обучения для исследования физических свойств биополимеров в волосах

Физические свойства и измерения волос

Образцы волос, собранные у разных видов животных, были проанализированы с помощью нескольких методов измерения: ЯМР твердого тела, ТД-ЯМР, FT-IR и TG-DTA.Для твердотельного ЯМР были зарегистрированы широколинейные (анизотропные) спектры 1 H, 1 H MAS (изотропные) и 13 C CP-MAS спектры. На рис. 1 показаны усредненные данные каждого измерения. Спектры с широкими линиями 1 H демонстрировали типичную для твердых образцов форму линии, которая уширяется в диапазоне 100 миллионных долей из-за различной ориентации диполярных взаимодействий (рис. 1a и рис. S1a). В то же время относительно узкий пик наблюдался около 0 м.д.Эти формы линий в широколинейных спектрах 1 H указывают на то, что образцы волос содержат композиции с различной молекулярной подвижностью или анизотропным взаимодействием 15 . В то же время спектры MAS 1 H показали характерные пики в более узкой области спектра, обусловленные усредненными изотропными взаимодействиями MAS (рис. 1б). Некоторые острые пики от 0,8 до 2,3 м.д. были приписаны липидным композициям 43,44 . Липидные пики были наиболее отчетливы в волосах кошек и почти не наблюдались в волосах свиней (рис.С2а). Относительно широкий пик около 2,8–7,0 частей на миллион охватывает Hα аминокислот, которые в основном представляют собой кератины 43,45 . Кроме того, форма линии, широко расширяющаяся от - 5 до 14 частей на миллион, может представлять сильно анизотропные и жесткие компоненты, такие как структурированные кератины. Спектры 13 C CP-MAS демонстрируют отчетливые пики алифатических углеродов боковой цепи, метиновых углеродов Cα аминокислот, ароматических углеродов и карбонильных углеродов около 10–40 м.д., 45–60 м.д., 115–158 м.д. и 165 м.д. –178 млн соответственно (рис.1в) 9,28,43,46,47,48 . Волосы свиньи показали относительно более высокую интенсивность карбонильных углеродов, приписываемую форме α-спирали около 176 частей на миллион, среди типов волос (рис. S3a) 9,28,46,47 . Сигналы, наблюдаемые с помощью TD-NMR, быстро затухали в более раннее время, затем постепенно уменьшались до нуля (рис. 1d). Кривые затухания продемонстрировали присутствие в волосах композиций с различной скоростью релаксации или подвижностью 49 . Это согласуется с формой линий спектров ЯМР с широкими линиями 1 Н.Кривые TD-NMR волос показали схожую тенденцию для каждого вида, тогда как одновременно присутствовали существенные различия, зависящие от донора (рис. S4a). Спектры FT-IR также показали характерные пики поглощения белков и липидов (рис. 1e). Пики амида A, амида I, амида II и амида III, полученных из белков, наблюдались около 3277, 1634, 1516 и 1234 см -1 соответственно 50,51,52 . Метил- и метиленовая растяжка при 2958 и 2850 см -1 характерны для липидов 53 .Волосы каждого вида демонстрировали схожие спектральные картины с вариациями интенсивности, особенно на липидных пиках (рис. S5a). ТГ-ДТА позволил получить кривые ДТГ образцов волос (рис. 1f). Потеря массы при 100 °C представляет собой удаление свободной воды 54,55,56 . В соответствии с предыдущими отчетами 11,31 отчетливая потеря массы примерно до 240 °C считалась пиролизом коры. После пиролиза коры оставшаяся кутикула образует «микротрубочки», освобожденные от коркового материала. Последующая потеря массы должна соответствовать разложению микротрубок, которому, возможно, могло бы предшествовать удаление связанной воды 54,57 .Карбонизация остальных компонентов продолжалась до достижения конечной температуры 500 °С. Волосы человека показали несколько более высокие значения на кривых DTG при температуре около 240–260 ° C, чем волосы других видов (рис. S6a).

Рисунок 1

Измерения волос. Образцы волос подвергали ( a ) твердофазным ЯМР экспериментам для получения широколинейных спектров 1 H, ( b ) 1 H спектров MAS и ( c ) 13 C CP- спектры МАС; ( d ) TD-NMR для затухания намагниченности, ( e ) FT-IR спектроскопия и ( f ) TG-DTA для получения кривых DTG.Показаны усредненные данные после нормализации.

Образцы волос также были подвергнуты испытанию на растяжение для оценки следующих физических свойств: разрывное усилие, модуль упругости, удлинение и предел текучести. Усредненные значения физических свойств каждого образца волос нанесены на график со стандартными отклонениями на рис. S7. Разрывная сила была высокой для свиного волоса (медиана 6,02 Н) и относительно низкой для кошачьего волоса (медиана 0,21 Н), что хорошо коррелировало с площадью поперечного сечения (рис.С7а). Между тем, коровьи волосы продемонстрировали относительно высокий модуль упругости (медиана 4,6 ГПа) (рис. S7b), а человеческие волосы показали немного более высокое удлинение (медиана 65%) (рис. S7c) среди протестированных типов волос. Предел текучести среди протестированных типов волос был относительно низким для кошачьего (99 МПа) и человеческого волоса (105 МПа), тогда как для коровьего волоса он был высоким (177 МПа) (рис. S7d). Из-за характерных свойств, зависящих от вида, а также от отдельных доноров, собранные образцы волос показали значительное разнообразие значений физических свойств.Здесь следует отметить, что из-за внутренних биологических вариаций в каждом пуле образцов волос наблюдаемые значения показали значительные вариации, что привело к значительным стандартным отклонениям (рис. S7).

Генерация дескрипторов измерений

Данные измерений волос были преобразованы в «дескрипторы измерений» путем обработки данных, включая спектральное дифференцирование, бинирование, уменьшение размеров с помощью PCA или деконволюцию кривой (рис. 2). Дифференцирование второго порядка было применено к спектрам 1 H с широкой линией, 1 H MAS, 13 C CP-MAS ЯМР-спектрам, ИК-Фурье-спектрам и кривым ДТГ, чтобы улучшить характеристики профилей. .Дифференциация также эффективна для коррекции смещения или линейного дрейфа базовой линии. Биннинг был проведен для расчета средних значений в определенных областях профилей, чтобы представить характеристические пики как разрешенные. Уменьшение размерности направлено на извлечение коррелирующих наборов переменных для эффективного представления характеристик данных. Деконволюция кривых для спектров ЯМР с широкими линиями 1 Н и кривых затухания TD-ЯМР заключалась в разделении смешанных сигналов на небольшое количество компонентов путем подгонки функций.Схемы сгенерированных бинов и компонентов после деконволюции показаны вместе с соответствующими результатами измерений на рис. С1–С6. Следовательно, всего было сгенерировано 902 дескриптора. Все дескрипторы измерений подробно описаны в таблице S1.

Рисунок 2

Схема разработки дескрипторов измерения. Необработанные измеренные данные волос были предварительно обработаны с дифференциацией или без нее. Предварительно обработанные данные впоследствии подвергались обработке биннингом, уменьшением размерности или деконволюцией кривой.Затем из данных, измеренных с помощью различных аналитических методов, были сгенерированы различные «дескрипторы измерений»: всего 902 дескриптора.

Для обзора взаимосвязи между сгенерированными дескрипторами и физическими свойствами был проведен CCorA. CCorA определяет набор линейных комбинаций переменных в двух наборах данных (т. е. физических свойств и дескрипторов измерений), чтобы максимизировать корреляцию между ними 58 . Результаты CCorA были получены для наборов дескрипторов каждого измерения (рис.S8) и комбинированный набор (рис. 3). Разрывная сила была нанесена с относительно большой оценкой (~ 1) на первой или наиболее доминирующей канонической оси на всех графиках. Эта тенденция показала, что разрывная сила хорошо объяснялась подготовленными дескрипторами. С другой стороны, модуль упругости, растяжение и предел текучести были выражены в основном на второй канонической оси на большинстве графиков. Кроме того, модуль упругости и предел текучести были нанесены близко друг к другу. Этот результат показывает, что эти два свойства имеют аналогичную корреляцию с измеренными данными.Между тем, расширение было нанесено на противоположную сторону графика, что указывает на различную и отчетливую корреляцию с измерениями (рис. 3). Относительный вклад измеренной информации в физические свойства было трудно сравнить на основе этих результатов CCorA. Тем не менее, некоторые из менее многообещающих дескрипторов, на которые указывают небольшие баллы за физические свойства, были дескрипторами спектров ЯМР с широкой линией 1 H для удлинения (рис. S8a) и дескрипторами спектров 1 H-MAS ЯМР для модуля упругости ( Инжир.С8б).

Рисунок 3

Анализ канонической корреляции между физическими свойствами и дескрипторами измерений волос. Наборы данных дескрипторов измерения были подготовлены из всех экспериментов с использованием корреляции менее 0,3. Наборы данных физических свойств и дескрипторы измерений были стандартизированы заранее. Расчетные баллы для дескрипторов спектров 1 H с широкой линией, 1 H MAS и 13 C CP-MAS ЯМР-спектров; Спектры TD-NMR и FT-IR, а также кривые DTG были построены с незакрашенными точками красного, оранжевого, зеленого, синего, фиолетового и черного цвета соответственно.Баллы физических свойств разрывного усилия (BF), модуля упругости (EM), растяжения (EX) и предела текучести (YS) представлены сплошными стрелками.

Прогнозирование физических свойств с помощью дескрипторов измерений

Дескрипторы измерений были дополнительно связаны с физическими свойствами путем построения моделей прогнозирования с использованием RF и PLSR, которые представляют собой нелинейный и линейный алгоритмы соответственно. Здесь каждое из физических свойств (выходные данные) было предсказано дескрипторами измерений (входными данными), сгенерированными из их соответствующих или всех измерений.Построенные модели были проверены десятикратным CV. Десятикратное CV было повторено 100 раз, а затем были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения RMSE и R 2 (таблица S2). Согласно результатам CCorA, разрывное усилие было предсказано точно с высоким значением ~ 0,913; между тем, предсказания модуля упругости, растяжения и предела текучести показали относительно низкую точность или отсутствие значимых корреляций ( R 2  < 0.4). Ожидалось, что набор дескрипторов, объединенный из всех измерений, обеспечит превосходные прогнозы с использованием нескольких типов измеренной информации. Однако точность предсказания, полученная с помощью комбинированного набора дескрипторов, была сравнима или немного хуже, чем у дескрипторов из каждого измерения. Этот результат показал, что наличие некоррелированных дескрипторов измерения в наборе объясняющих переменных, возможно, препятствует эффективному прогнозированию, что затрудняет интегративную интерпретацию.Следовательно, выбор дескрипторов, принятых для прогнозного моделирования, был необходим для повышения точности прогноза, а затем для определения тех, которые вносят значительный вклад в физические свойства.

Выбор и интерпретация дескрипторов измерений

Для реализации надежной интегративной интерпретации нескольких измеренных данных требуются достаточные корреляции с помощью прогностического моделирования. Таким образом, впоследствии был выполнен выбор вспомогательных дескрипторов измерений из всех 902 сгенерированных с целью повышения производительности модели.При построении модели RF или PLSR важность каждого дескриптора измерения оценивалась с помощью 100 повторений десятикратного CV. После этого 90% дескрипторов измерения, ранжированных с более высокими значениями важности, использовались для построения следующей модели, после чего количество принятых дескрипторов ступенчато сокращалось. Точность прогнозирования (т.е. RMSE и R 2 ) моделей RF и PLSR, построенных на каждом этапе, показана для их соответствующих физических свойств (выходных данных) на рис. 4. Как правило, начиная с 902 дескрипторов, Значения R 2 сначала возрастали (а СКО уменьшались), затем достигали максимума.Этот процесс должен соответствовать исключению незначимых дескрипторов. Дальнейшее уменьшение количества дескрипторов привело к уменьшению значений R 2 , что свидетельствует об исключении вспомогательных дескрипторов. Следовательно, уточненные наборы дескрипторов, показавшие самые высокие значения, были определены как лучшие среди каждой серии отбора. В то же время для значимых корреляций были обеспечены значения более 0,5.На рис. S9 показаны графики предсказанных значений физических свойств с лучшими наборами дескрипторов в сравнении с наблюдаемыми значениями. В результате модели RF и PLSR для каждого физического свойства показали общие дескрипторы 20-й степени важности (рис. 5). Такие дескрипторы, обычно выбираемые двумя разными алгоритмами, указывали на выбор надежных дескрипторов на основе оценки важности и были бы особенно полезны для интерпретации связи с физическими свойствами. Как тенденции, разрывная сила в значительной степени зависит от дескрипторов спектров 1 H MAS и 13 C CP-MAS ЯМР; предсказания модуля упругости, растяжения и предела текучести в основном были связаны с дескрипторами спектров FT-IR и кривых DTG.Кроме того, процесс выбора дескриптора значительно способствовал уменьшению ошибок прогнозирования (рис. 4 и таблица 1). Несмотря на то, что наблюдаемые физические свойства сами по себе включали значительные вариации в каждом образце волос (рис. S7), RMSE, полученный в лучших моделях, был значительно ниже, чем экспериментальные стандартные отклонения, а R 2 превышал 0,5 (таблица 1). Этот результат показывает, что разработанные прогностические модели существенно отражали корреляцию между наблюдаемыми физическими свойствами.В то же время не чрезмерная R 2 указывает на результат избегания переподгонки к экспериментальным ошибкам наблюдаемых физических свойств, а также соответствующих измерений.

Рисунок 4

Выбор дескрипторов измерения для предсказания физических свойств волос. Ряды прогнозных моделей были построены для ( a ) разрывной силы, ( b ) модуля упругости, ( c ) растяжения и ( d ) предела текучести с использованием случайного леса (RF) (вверху, черные маркеры). ) и частичной регрессии методом наименьших квадратов (PLSR) (внизу, серые маркеры).Количество принятых дескрипторов было постепенно уменьшено с 902. Точность предсказания R 2 (кружки) и RMSE (треугольники) оценивались на каждом этапе. Наилучшие результаты с наивысшим значением R 2 обозначены красными стрелками для каждой серии моделей.

Рисунок 5

Дескрипторы измерений, выбранные для прогнозирования физических свойств волос. 20 лучших дескрипторов, выбранных с использованием случайного леса (RF) (вверху, черные столбцы) и частичной регрессии наименьших квадратов (PLSR) (внизу, серые столбцы), перечислены с оцененной важностью для ( a ) разрушающей силы, ( b ) модуль упругости, ( c ) растяжение и ( d ) предел текучести.Дескрипторы, обычно выбираемые RF и PLSR, выделены красным цветом.

Таблица 1. Прогнозирование физических свойств с использованием наборов дескрипторов измерений, выбранных как наилучшие.

На основе дескрипторов, обычно выбираемых алгоритмами RF и PLSR до 20-го наилучшего (рис. 5), описывается интегративная интерпретация взаимосвязи между соответствующими физическими свойствами. Разрывная сила выбрана несколькими дескрипторами спектров ЯМР MAS 1 H, около 3.1–3,9 м.д. и 5,6–6,8 м.д., что указывает на обе стороны пика с участием аминокислоты Hα (синие стрелки на рис. 6а). Эти сигналы можно отнести к белкам с сильной анизотропной диполярной связью и, следовательно, с медленной подвижностью. Кроме того, дескриптор, выбранный на спектрах 13 C CP-MAS («cpmas.95»), соответствует карбонильным атомам углерода в форме α-спирали около 176 м.д. (рис. 6b) 9,28,46,47 . α-спирали и спирально-спиральные структуры кристаллических волокнистых кератинов являются отличительными чертами коркового компонента.Следовательно, доля жестких пучков α-кератина в коре была связана с сопротивлением волоса растяжению, а также с площадью поперечного сечения. Этот результат также продемонстрировал, что дескрипторы измерения успешно отражают вторичную структуру и подвижность кератинов. В то же время ожидается, что дескрипторы спектров ЯМР с широкой линией 1 Н и TD-ЯМР будут проявлять молекулярную подвижность; однако их редко выбирали. Этот результат показал, что дескрипторы спектров 1 H MAS и 13 C CP-MAS ЯМР были в значительной степени эффективными, поскольку они были хорошо разрешены в спектрах, а затем связаны с соответствующими молекулярными составами.

Рисунок 6

Назначение дескрипторов измерения измеренным данным. Дескрипторы, обычно выбираемые как для моделей RF, так и для моделей PLSR, показаны стрелками для разрывной силы (синий), модуля упругости (оранжевый), растяжения (розовый) и предела текучести (зеленый) на ( a ) второй производной 1 H MAS спектр, ( b ) непроизводная 13 C CP-MAS спектры ЯМР, ( c ) непроизводная кривая и кривая второй производной DTG и ( d ) вторая производная FT-IR спектр.Символы некоторых отличительных дескрипторов также обозначены соответствующими цветами физических свойств на каждом рисунке.

Отличительными дескрипторами, выбранными для модуля упругости, были «dtg.2der.36» и «dtg.2der.37» кривых DTG и «ftir.2der.51» спектров FT-IR. «dtg.2der.36» и «dtg.2der.37» соответствуют диапазону 265–276 ° C кривых второй производной DTG (оранжевые стрелки на рис. 6c). Этот температурный диапазон может быть связан с разложением кутикулы, особенно микротрубочек, после исчезновения коры 11,31 .Коровья шерсть с высоким модулем упругости показала высокие или положительные значения этих дескрипторов, что указывало на относительно низкую скорость потери массы в этом температурном диапазоне. Более того, «ftir.2der.51» указывает на поглощение амида I при 1631–1649 см -1 , что соответствует структуре случайного клубка (рис. 6d) 50,51,52,59,60,61 . Метод FT-IR ATR измеряет только поверхность образца глубиной в несколько микрометров. Таким образом, «ftir.2der.51» предположительно соответствует аморфным кератинам кутикулы.Между тем, волокнистые кристаллические кератины в коре остаются в α-спиральной форме при удлинении от нуля до нескольких процентов для оценки модуля упругости на основе закона Гука 14,62,63,64 . Поэтому мы предположили, что модуль упругости зависит от количества дисульфидных связей или запутанности аморфного кератина в кутикуле, а не в кортексе.

Расширение связано с некоторыми дескрипторами кривых ДТГ («dtg.21», «dtg.22» и «dtg.45») (рис. 6в), спектров FT-IR (рис.6d) и спектры 13 C CP-MAS ЯМР («cpmas.66») (рис. 6b). Упомянутый диапазон (244–263 °C) кривых ДТГ в вышеупомянутых дескрипторах, возможно, связан с потерей связанной воды в кутикуле. «ftir.2der.52» и «ftir.2der.31» представляют собой пики амида I и амида III при 1651–1669 и 1246–1264 см -1 соответственно (розовые стрелки на рис. 6d). Эти области могут быть назначены структурам β-витка или произвольной катушки 50,51,52,59,60,61,65 . В то же время, удлинение волос увеличивается с увеличением влажности 14,64 .Таким образом, выбранные дескрипторы потенциально продемонстрировали, что неорганизованные аморфные кератины в кутикуле обеспечивают доступ к воде, а затем усиливают наращивание волос. Другие области, выбранные на спектрах FT-IR: 2763–2781 («ftir.2der.60»), 976–993 («ftir.2der.17»), 822–839 («ftir.2der.9»), и 783–800 см −1 («фтир.2дер.7»). Хотя отнесение было трудным, эти дескрипторы, возможно, представляют гидрофильные группы (например, C-O и NH) в белках, которые связаны с ассоциацией с водой.«cpmas.66» представляет собой сигнал около 124 м.д. в спектрах 13 C CP-MAS ЯМР, который может быть результатом гидрофильных ароматических аминокислот, таких как тирозин. «дтг.45» тоже трудно понять, но мог представлять собой науглероживание жаростойких составов.

Наконец, предел текучести в значительной степени зависел от дескрипторов кривых ДТГ (рис. 6c) и спектров FT-IR (рис. 6d). Некоторые из выбранных дескрипторов (например, «dtg.2der.36», «dtg.2der.37» и «ftir.2der.51») были общими с модулем упругости, что согласуется с результатами CCorA (рис.3 и рис. S8). «dtg.22» и «dtg.23» представляют диапазон 254–273 °C на кривой ДТГ и почти перекрывают области «dtg.2der.36» и «dtg.2der.37». «dtg.31»–«dtg.34» для диапазона 344–383 °C отличались пределом текучести (зеленые стрелки на рис. 6c), который был выше для кошачьей шерсти и ниже для коровьей и свиной шерсти. Эти дескрипторы предположительно указывают на высокотермостойкие компоненты в слоях кутикулы, которые вызывают ломкость волос.

Точность прогнозирования модуля упругости, растяжения и предела текучести не была высокой по сравнению с показателями прочности на разрыв (таблица 1).Этот результат указывает на то, что модуль упругости, растяжение и предел текучести нуждаются в дополнительной информации для достаточного описания. В то же время ошибки оцениваемых значений физических свойств, которые не учитывались при построении модели, возможно, препятствовали достижению более высокой точности прогноза. Тем не менее, дескрипторы измерения и стратегия отбора, продемонстрированные в настоящем исследовании, успешно обеспечили представление о взаимосвязях с соответствующими физическими свойствами. Кроме того, другие выбранные дескрипторы, которые не обсуждались выше, могут поддерживать интерпретацию физических свойств.Улучшения производительности модели можно ожидать за счет увеличения разнообразия доноров волос и увеличения числа повторений тестирования и измерений физических свойств соответствующими аналитическими методами. Кроме того, оценка важности и выбор дескрипторов могут выполняться с использованием других алгоритмов моделирования 66 . Они заслуживают дальнейшего детального изучения в будущем.

Что касается обработки данных, дифференциация оказалась эффективной для усиления характеристик перекрывающихся или широких сигналов, особенно в спектрах 1 H MAS ЯМР и кривых DTG.Кроме того, выбранные выше дескрипторы измерений в основном были сгенерированы путем бинирования, а не уменьшения размерности и деконволюции кривой. Это связано с тем, что бинирование позволяет сжимать измеренную информацию более конкретно для определенных молекулярных структур, динамики и экспериментальных событий. В то же время существуют альтернативные методы уменьшения размерности и деконволюции, такие как анализ независимых компонентов 67 , неотрицательная матричная факторизация 68 и t-распределенное стохастическое встраивание соседей 69 , которые могут быть полезны для более эффективного извлечения измеренной информации, чем PCA.Дальнейшее изучение методов обработки данных будет способствовать разработке дескрипторов с более эффективной и потенциально композиционной информацией.

Преформация и эпигенез сходятся, чтобы определить судьбу первичных зародышевых клеток у ранних эмбрионов дрозофилы

Abstract

Важным этапом в развитии животных является спецификация первичных зародышевых клеток (ПЗК), предшественников зародышевой линии. В животном мире реализуются два, казалось бы, взаимоисключающих механизма: эпигенез и преформация.В эпигенезе спецификация PGC не является автономной и зависит от внешних сигнальных путей. Путь BMP обеспечивает ключевые сигналы спецификации PGC у млекопитающих. Преформация автономна и опосредована детерминантами, локализованными в PGCs. У Drosophila , классического примера преформации, считается, что компоненты зародышевой плазмы, локализованные в задней части эмбриона, необходимы и достаточны для правильного определения PGCs. Вопреки этой давней модели, здесь мы показываем, что этих локализованных детерминант самих по себе недостаточно для направления спецификации PGC у эмбрионов на стадии бластодермы.Вместо этого мы обнаружили, что сигнальный путь BMP необходим на множестве стадий процесса спецификации и функционирует в сочетании с компонентами зародышевой плазмы, чтобы управлять судьбой PGC.

Резюме автора

Правильная спецификация первичных половых клеток (ПЗК) имеет решающее значение, поскольку ПГК служат предшественниками стволовых клеток зародышевой линии. Чтобы определить судьбу PGC, беспозвоночные полагаются на автономное преформирование клеток с участием депонированной материнской зародышевой плазмы. В Drosophila melanogaste r, чтобы изолировать вновь образованные PGCs от неблагоприятных эффектов межклеточных сигнальных путей, детерминанты зародышевой плазмы подавляют транскрипцию и ослабляют клеточный цикл.Однако наши данные о сигнальном пути BMP бросают вызов этому давнему взгляду на спецификацию PGC и предполагают, что соответствующая спецификация эмбриональных PGC чувствительна к лиганду BMP, decapentaplegic ( dpp ), и его родственному рецептору, толстым венам . Мы обнаружили, что PGC не только способны реагировать на сигналы BMP от сомы, но также и то, что эти сигналы влияют на правильное определение зародышевых клеток. Основываясь на этих непредвиденных сходствах между млекопитающими и мухами, мы предлагаем модель, объединяющую вклад как клеточно-автономных (преформация), так и неавтономных (эпигенез) путей во время определения PGC.В соответствии с моделью, мы наблюдали доминирующие генетические взаимодействия между oskar , материнской детерминантой судьбы PGC, и лигандом пути BMP dpp .

Образец цитирования: Colonnetta MM, Goyal Y, Johnson HE, Syal S, Schedl P, Deshpande G (2022) Преформация и эпигенез сходятся, чтобы определить судьбу первичных зародышевых клеток в раннем эмбрионе Drosophila . PLoS Genet 18(1): е1010002. https://doi.org/10.1371/журнал.pgen.1010002

Редактор: Джованни Боско, Медицинская школа Гейзеля в Дартмуте, США

Получено: 30 июля 2021 г .; Принято: 17 декабря 2021 г .; Опубликовано: 5 января 2022 г.

Авторское право: © 2022 Colonnetta et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Работа выполнена при поддержке гранта Национального института здравоохранения (HD0

  • ) П.С. и G.D., и (GM126975) в P.S. М.М.С. был поддержан стипендией NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1656466). Ю.Г. был поддержан наградой BWF CASI. Х.Э.Дж. был поддержан стипендией Рут Киршштейн (F32GM119297). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Половое размножение позволяет многоклеточным организмам передавать генетическую информацию от одного поколения к другому. Процесс инициируется дифференцировкой гониобластов, образующихся в результате асимметричного деления мужских и женских стволовых клеток зародышевой линии (GSC), и завершается слиянием мужских (сперматозоидов) и женских (яйцеклеток) гамет с образованием эмбриональной зиготы.ГСК половозрелых животных не возникают de novo . Скорее, они происходят из особой группы клеток, первичных зародышевых клеток (ПЗК), которые отделяются от остальных соматических клеток на очень ранней стадии эмбрионального развития. Поскольку правильная спецификация PGCs имеет решающее значение для прогрессирования репродуктивного цикла, механизмы, лежащие в основе их формирования и спецификации судьбы, были в центре внимания исследований [1-6].

    Многие характерные черты спецификации PGC в целом сохраняются в животном мире.Одним из ключевых этапов спецификации PGC у большинства животных является подавление транскрипции. Однако механизмы, лежащие в основе установления и/или поддержания транскрипционного покоя, разнообразны [6–10]. Например, у млекопитающих предшественники клеток, которые в конечном итоге дают начало зародышевой линии, подвергаются активации зиготического генома (ZGA), как и другие клетки эмбриона; однако после начальных шагов спецификации PGC транскрипция соматических генов в значительной степени прекращается, и эти клетки начинают возвращаться к более раннему, плюрипотентному состоянию [6-8].У червей линия клеток, производящая зародышевую линию, отделяется при первом делении, и, когда транскрипция начинается в оставшихся соматических клетках на стадии 3–4 клеток, она остается транскрипционно неактивной, как и дочерние клетки в линии, предназначенной для стать зародышевой линией [9, 10].

    У мух PGCs формируются после начала малой волны ZGA, которая начинается в ядерном цикле (NC) 8. Во время их формирования текущая транскрипция выключается зародышевой клеткой без ( gcl ) [11]. , 12], в то время как гены, активированные во время большой волны ZGA (NC14), удерживаются в выключенном состоянии за счет комбинированного действия компонента полярных гранул ( pgc ) [13–15] и nanos ( nos ) [16–18]. ].Широкое подавление транскрипции отражается в статусе фосфорилирования CTD-домена РНК-полимеразы II. PhosphoSer2, модификация, коррелирующая с удлинением транскрипции, практически отсутствует во вновь образованных PGC, в то время как PhosphoSer5, модификация, связанная с инициацией, существенно снижена [14, 17, 19, 20]. Второй общей чертой являются изменения в профилях модификации гистонов. У червей и мух гистон h4meK4, модификация, связанная с активной транскрипцией, практически отсутствует в молодых PGCs.У обоих организмов детерминанта зародышевой линии под номером способствует ингибированию этой модификации гистонов [21]. Кроме nos , для подавления модификации h4meK4 у мух необходимы деметилаза h4meK4, Su(var)3-3 , субъединица комплекса ремоделирования хроматина Swi/Snf, osa [14], и регулятор транскрипции pgc . [13, 14]. Имеются также изменения в модификации гетерохроматинового гистона h4meK9 [21]. Подобно червям и мухам, мышиные PGC также обнаруживают изменения в модификациях гистонов [20, 22, 23].Третьей общей чертой является приостановка клеточного цикла. У червей, мух и млекопитающих PGCs останавливают клеточный цикл в G2 [17, 20, 24-26]. В дополнение к этим общим характеристикам гены, участвующие в спецификации PGC у модельных беспозвоночных (мухи или черви), такие как nos , vasa и piwi , также сохраняются у высших животных (мыши, человек и т. д.) [1]. , 8, 9].

    В то время как многие характеристики PGC, которые отличают их от сомы, широко распространены среди разных видов животных, существует одна поразительная дихотомия, а именно, является ли механизм, управляющий спецификацией, «эпигенезом» или «преформацией».В эпигенезе спецификация не является автономной и зависит от межклеточной передачи сигналов. В предварительном формировании спецификация автономна и управляется детерминантами, локализованными в предполагаемых PGC. Млекопитающие используют эпигенез. У преимплантационных эмбрионов комбинация индуктивных сигналов от внеэмбриональной эктодермы и висцеральной энтодермы действует, чтобы индуцировать клетки в заднем эпибласте, чтобы стать PGCs [6, 7, 27]. Передача сигналов, по-видимому, представляет собой, по крайней мере, двухэтапный процесс, в котором Wnt3 (Wingless 3) сначала примирует клетки в эпибласте.После праймирования клетки могут реагировать на лиганды BMP (bone morphogenetic protein) Bmp4 и Bmp8b, которые секретируются внеэмбриональной эктодермой, и Bmp2, который секретируется висцеральной энтодермой [28-31]. Эти сигналы активируют факторы транскрипции Smad, которые запускают программу транскрипции, необходимую для спецификации PGC [32-34]. Напротив, считается, что черви и мухи используют исключительно механизм преформирования с участием локализованных клеточно-автономных факторов. У червей локализованные детерминанты PGC сегрегируют только в одну из дочерних клеток во время каждого из клеточных делений бластомера, что в конечном итоге приводит к двум основателям PGC, Z2 и Z3 [9, 35].У эмбрионов мух за оплодотворением следует серия быстрых синхронных ядерных делений, которые завершаются целлюляризацией в конце NC14 [36]. Однако ранее, во время NC9, несколько ядер мигрируют к заднему полюсу зародыша и индуцируют образование полюсных зачатков [37]. Во время формирования почки сеть центросом/микротрубочек, ассоциированная с каждым входящим ядром, запускает высвобождение локализованных детерминант PGC из заднего коркового цитоскелета, и эти факторы затем включаются во вновь образованные PGC во время целлюляризации [37, 38].Когда эти факторы не изолированы должным образом во вновь образованных PGC, спецификация PGC не выполняется [12, 38-40].

    Главным детерминантом, который управляет формированием PGC и последующей спецификацией у мух, является oskar ( osk ) [41]. osk мРНК локализуются на заднем полюсе ооцита во время оогенеза и транслируются в середине оогенеза [42]. Затем белок Osk обеспечивает рекрутирование и сборку ключевых компонентов зародышевой плазмы, включая белки Vasa, Tudor, Valois и Aubergine, а также мРНК pgc , gcl и nos .После сборки в задней части яйца зародышевой плазмы достаточно, чтобы вызвать образование PGCs. Illmensee и Mahowald показали, что инъекция полярной плазмы в переднюю часть эмбриона индуцирует образование эктопических PGCs [43]. Это открытие повторили Эфрусси и Леманн, которые заменили osk 3’ UTR на bicoid ( bic ) 3’ UTR [44]. Они обнаружили, что полюсной плазмы, собранной эктопическим белком Osk, достаточно, чтобы индуцировать образование полностью функциональных PGCs в передней части эмбриона.Кроме того, сверхэкспрессия osk увеличивает количество PGCs и может также индуцировать эктопические PGCs на дорсальной стороне эмбриона [45].

    Эти и др. находки подкрепили идею о том, что механизм преформации, опирающийся исключительно на локализованные детерминанты, отвечает за спецификацию PGC у мух. Однако позже в эмбриогенезе PGCs не являются ни индифферентными, ни невосприимчивыми к внеклеточным сигналам. Как и в случае с др. организмами, PGCs мух должны мигрировать из места их формирования на заднем полюсе через эмбрион, чтобы сливаться с клетками-предшественниками соматических гонад (SGPs) [46].Их миграция через мезодерму опосредуется сигнальным путем Hedgehog (Hh) и направляется потенцированным лигандом Hh, продуцируемым SGPs [47-49]. Примерно в те же временные рамки (стадия 10-14 эмбриогенеза) PGCs мух не только реагируют на передачу сигналов BMP, но и зависят от сигналов BMP для поддержания своей идентичности. Когда BMP рецептор толстых вен ( tkv ) нокдаун с использованием специфичного для зародышевой линии драйвера nos-Gal4 , накопление белка Vasa в PGCs нарушается, в то время как сборка специфичной для зародышевой линии спектросомы нарушается [50].В то время как hh направленная миграция PGC, по-видимому, обеспечивается новым нетранскрипционным путем [49, 51], поддержание судьбы PGC у эмбрионов на стадии 9-14 зависит от канонических факторов транскрипции ниже BMP. Nos-Gal4 зависимый нокдаун кофактора Smad medea , зависящий от РНКи, нарушает накопление белка Vasa. Сходным образом сверхэкспрессия smurf , ubiquitin E3 ligase, которая нацелена на фосфорилированный (и активный) Smad для деградации, вызывает дефекты в накоплении Vasa и сборке спектросом [50].

    Эти находки показывают, что в середине эмбриогенеза, в период, ведущий к слиянию гонад, путь BMP не только помогает поддерживать идентичность PGC, но также способствует дифференцировке PGC в GSCs. Это предполагает, что, по крайней мере, в этот период одних только материнских детерминант недостаточно ни для поддержания идентичности PGC, ни для стимулирования дифференцировки. Если это так, уместный вопрос заключается в том, достаточны ли локализованные материнские детерминанты сами по себе для спецификации PGCs у эмбрионов доклеточной бластодермы или они также требуют входных данных от сигнального пути BMP даже на этой стадии развития. .Вот мы и рассмотрели этот вопрос.

    Результаты

    Ранняя эмбриональная сверхэкспрессия

    dpp приводит к умеренному увеличению количества PGC из-за усиленного митоза

    Исследования Dorfman и Shilo показали, что новообразованные PGCs в синцитиальных и клеточных эмбрионах бластодермы не являются иммунными к сигнальному пути BMP [52]. Как и их соматические аналоги на дорсальной стороне эмбриона, активированные pMad накапливаются до высоких уровней в ядрах PGC, и эта аккреция зависит как от рецептора tkv , так и от его лиганда, decapentaplegic ( dpp ) [53–55].Как и следовало ожидать, исходя из накопления pMad в ядрах PGC, предыдущие исследования экспрессии мРНК dpp и лиганда Dpp показали, что, хотя домен экспрессии dpp у ранних эмбрионов ограничен дорсальной стороной эмбриона, он охватывает весь задний (и передний) полюс зародыша [56]. В зародышевых клонах эмбрионов, гомозиготных по мутации tkv ( FRTtkv 8 , обозначаемых как tkv m- ), вновь образованный pMad полностью теряется в pMad.Когда эмбрионы tkv m- оплодотворяются спермой WT tkv , зиготическая экспрессия может частично смягчать дефекты накопления pMad как в соме, так и во вновь образованных PGCs. Это указывает на то, что в отличие от многих других генов, транскрипция которых специфически выключена в PGCs, транскрипция tkv не отключена [52]. Тот факт, что tkv входит в число немногих генов, о которых известно, что они транскрибируются во вновь образованных PGC, предполагает, что накопление pMad может выполнять важную функцию.С др. стороны, также возможно, что pMad-зависимая индукция нижестоящих мишеней блокируется материнской детерминантой(ами), которая подавляет глобальную транскрипцию во вновь образованных PGCs. В этом случае PGCs будут невосприимчивы к нормальной активности ядерного pMad.

    Чтобы проверить, реагируют ли новообразованные PGC на входы от сигнального пути BMP, мы создали избыточный уровень Dpp, используя twist-Gal4 , чтобы стимулировать экспрессию трансгена UAS-dpp на вентральной стороне эмбриона.В соответствии с идеей о том, что PGCs сохраняют способность реагировать на передачу сигналов BMP, вероятно, посредством фосфорилирования и ядерной локализации pMad, мы обнаружили, что избыток Dpp приводит к умеренному, но значительному увеличению количества PGCs как на стадии 4 синцитиальной бластодермы (S1A и S1B Fig и S1 Table) и на стадии 5/6, т.е. на стадии поздней синцитиальной/клеточной бластодермы (S1C и S1D Fig) (26,4 PGCs/эмбрион в twi-Gal4 / UAS-dpp , n = 16; по сравнению с 21,9 ПГК на эмбрион, n = 20 в контроле, p = 0.0019 по t-критерию). Аналогичное повышение количества PGC также наблюдалось у эмбрионов на стадии синцитиальной/клеточной бластодермы, когда уровни Dpp повышались с использованием материнского тубулина-Gal4 (таблица S1; p = 0,027 по t-критерию).

    Поскольку PGC дикого типа делятся только 0-2 раза после того, как они сформированы, а затем прекращают деление к моменту целлюляризации эмбриона [57], увеличение числа PGCs может быть связано с неспособностью полностью выйти из клеточного цикла. Если эта идея верна, частота PGCs в митозе должна быть повышена у эмбрионов twi-Gal4 / UAS-dpp .Чтобы проверить эту возможность, мы идентифицировали PGCs в митозе, используя антитело к фосфогистону 3 (ph4) [58, 59]. У дикого типа ph4 относительно редко обнаруживается в PGC в период между их формированием и окончанием NC14 (рис. 1А и таблица S2; 0,7 полюсных клеток на эмбрион, n = 18). Напротив, это число значительно повышено (примерно в 4 раза) у эмбрионов twi-Gal4 / UAS-dpp , как показано на рис. 1B (2,8 полюсных клеток на эмбрион, n = 18; -тест) (рис. 1B и таблица S2). Это указывает на то, что сигнальный путь Dpp способствует пролиферации вновь образованных PGCs.

    Рис. 1. Эктопическая экспрессия dpp с использованием twist-Gal4 усиливает митоз, что приводит к умеренному увеличению количества PGC.

    (A/C) twi-Gal4 (B/D) или twi-Gal4/UAS-dpp Эмбрионы были окрашены на маркер PGC Vasa (AD, красный) и либо на ph4 (A’-B’), либо Циклин B (C’-D’) (синий) для оценки митотического состояния полюсных клеток. Избыток митотического маркера по сравнению с уровнями WT в PGCs обозначен звездочками (ph4) или знаками вставки (Cyclin B). Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g001

    Для дальнейшего анализа того, как избыток Dpp может способствовать делению PGC, мы исследовали экспрессию Cyclin B (CycB). В PGCs WT трансляция мРНК cyclin B специфически нацелена на репрессию комплексом Nanos:Pumilio [25, 26]. Следовательно, в PGC WT обнаруживаются только очень низкие уровни CycB (рис. 1C). Напротив, у эмбрионов twi-Gal4 / UAS-dpp CycB легко обнаруживается во многих PGCs (рис. 1D и таблица S2) (0.3 PGCs в контроле, n = 9, по сравнению с 2,2 PGCs у эмбрионов twi-Gal4 / UAS-dpp , n = 9; p = 0,0045 по t-критерию). Повышение уровня CycB у эмбрионов twi-Gal4 / UAS-dpp указывает на то, что Nos-зависимое ингибирование трансляции cyclin B нарушено. Интересно, однако, что мы не наблюдали какого-либо явного снижения уровней Vasa (рис. S2 и таблица S3; p = 1,0 по точному критерию Фишера) в twi-Gal4 / UAS-dpp PGCs.

    PGCs поддерживают транскрипцию в состоянии покоя в присутствии избытка передачи сигналов BMP

    При выключении транскрипции мРНК во вновь образованных ПЗС существенно снижается фосфорилирование Ser2 и Ser5 в гептадных повторах в CTD (С-концевой домен) большой субъединицы Pol II [13, 14, 19, 21, 60 ].Однако после активации транскрипции в PGCs уровень обеих модификаций CTD увеличивается [19]. Поскольку фосфорилирование и ядерная локализация pMad модулирует транскрипцию в соматических клетках [61], мы задались вопросом, нарушает ли избыток Dpp глобальное подавление транскрипции, обычно наблюдаемое в PGC WT. Поскольку накопление pSer2 достоверно сообщает об элонгации транскрипции, мы исследовали уровни pSer2 в twi-Gal4 / UAS-dpp и WT PGCs. Однако между эмбрионами twi-Gal4 / UAS-dpp и дикого типа не было заметной разницы (рис. S2 и таблица S3; p = 0.676744 по точному критерию Фишера). Таким образом, транскрипция PolII в PGCs не увеличивается при избытке Dpp.

    Накопление Vasa во вновь образованных PGC зависит от сигнального пути BMP

    Увеличение митотической активности, индуцированное избытком Dpp, указывает на то, что PGCs не являются ни индифферентными, ни невосприимчивыми к передаче сигналов BMP. Правдоподобным выводом из этого открытия является то, что, как и в случае с млекопитающими, передача сигналов BMP вносит вклад в спецификацию идентичности PGC у эмбрионов мух на стадии бластодермы.Чтобы начать исследовать эту возможность, мы сначала исследовали накопление белка Vasa в PGCs двух разных генетических фонов. Первый представляет собой жизнеспособный аллель с частичной потерей функции (LOF) лиганда dpp , dpp hr92 [62], тогда как второй представляет собой жизнеспособный частичный аллель LOF tkv рецептора, . ткв 427 [63]. Было показано, что уровни pMad снижаются у эмбрионов, скомпрометированных по компонентам передачи сигналов dpp , включая сам dpp [52].Это снижение pMad сопровождается снижением Vasa, маркера идентичности зародышевой линии (рис. 2В). Для dpp hr92 мы обнаружили, что 38% PGCs dpp hr92 имели заметно сниженные уровни Vasa (n = 63) по сравнению только с 8% для 9 WT (n = 63) (n = 63) (n = 63). Таблица S4, p = 0,00325 по точному критерию Фишера). В случае tkv 427 эмбрионов у 32% были снижены уровни Vasa (n = 53), в то время как Vasa был снижен только у 7% эмбрионов синцитиальной бластодермы WT (рис. 2C и таблица S4; p = 0). .00304 по точному критерию Фишера). Аналогичный результат был получен, когда мы проанализировали Vasa в PGCs эмбрионов, произведенных tkv m- матерей-клонов зародышевой линии, скрещенных с отцами дикого типа ( tkv m-z+ ). Мы обнаружили, что 32,8% из tkv m-z+ PGCs (n = 48; p = 3,4e-5 по точному критерию Фишера) показали пониженные уровни Vasa по сравнению с 2,1% PGCs в контрольных эмбрионах синцитиальной бластодермы (n = 47, таблица S4).

    Рис. 2. Эмбрионы, скомпрометированные для передачи сигналов BMP, демонстрируют потерю Vasa.

    Эмбрионы указанного генотипа окрашивали на маркер клеток полюса Vasa (белый) для визуализации количества PGC и уровней Vasa. (А) WT (б) DPP 3 HR92 HR92 (C) TKV 427 (D) DPPI 33618 (E) DPP 4 . Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g002

    Эти результаты показывают, что компоненты пути BMP влияют на накопление Vasa, PGC-специфического маркера, на ранних стадиях эмбриогенеза.Хотя это наблюдение указывает на то, что передача сигналов BMP влияет на спецификацию PGC, существует потенциальная сложность. Во всех трех экспериментах либо мать, либо материнская зародышевая линия были гомозиготными по мутации dpp или tkv . Хотя неизвестна роль пути BMP в сборке функциональной полярной плазмы во время оогенеза, это остается формальной возможностью. По этой причине мы использовали два разных подхода, чтобы установить, являются ли эффекты на Vasa строго зиготными, а не следствием какой-то недокументированной роли передачи сигналов BMP в сборке/функции полярной плазмы.Во-первых, мы использовали два UAS : DPPrnai трансгенов ( DPPI 33618 и DPPI и 25782 ) Чтобы сбить выражение DPP в эмбрионам стадии Blastoderm. В этих экспериментах мы скрещивали матерей, несущих трансген mat-tubulin-Gal4 , с отцами, гомозиготными по каждому трансгену UAS-dpp RNAi . Нокдаун dpp в предклеточных эмбрионах бластодермы нарушает накопление Vasa во вновь образованных PGCs (Fig 2D).Мы обнаружили, что 31,7% PGCs (n = 145) имели сниженный Vasa по сравнению с 2,9% PGCs (n = 136) у контрольных эмбрионов, у которых матери mat-tublin-Gal4 были скрещены с отцами, несущими UAS . : egfpi трансгена (таблица S4; p = 0,0 по точному критерию Фишера). Трансген dppi 25782 , хотя и несколько менее эффективный, дал аналогичные результаты (21,1% PGCs, n = 180) имел сниженные уровни Vasa (таблица S4; p = 1,0e-6 по точному критерию Фишера).

    Во втором подходе мы исследовали накопление Vasa в PGCs эмбрионов, гомозиготных по сильной мутации потери функции dpp , dpp 4 . Чтобы идентифицировать гомозиготные эмбрионы dpp 4 стадии бластодермы, мутацию dpp рекомбинировали с нулевым белком твист . Эмбрионы, полученные от скрещивания гетерозиготных родителей dpp 4 twi/CyO , исследовали с помощью комбинации антител Vasa и Twi.Как наблюдалось при нокдауне зиготических RNAi , уровни Vasa были снижены в PGCs гомозиготных dpp 4 twi эмбрионов. Мы обнаружили, что 27,8% PGCs (n = 248) у эмбрионов, у которых не определялся белок Twi, имели сниженный уровень Vasa по сравнению с 0,9% PGCs (n = 216) у Twi-позитивных братьев и сестер (таблица S4; p = 0,0 по точному критерию Фишера).

    Стабильность транскрипции частично нарушается при нарушении пути BMP

    Потеря Vasa во вновь образованных PGC предполагает, что путь BMP функционирует на ранней стадии спецификации PGC.Если это так, другие отличительные черты вновь образованных PGC также могут быть нарушены. Одним из них является установление транскрипционного покоя. Чтобы оценить влияние пути BMP на подавление транскрипции РНК Pol II, мы использовали несколько подходов. У WT сигнатура транскрипционной элонгации (pSer2) отсутствует в PGCs эмбриона на стадии синцитиальной бластодермы, в то время как она легко обнаруживается в соматических ядрах. Как показано для двух разных эмбрионов (рис. 3B и 3C), вновь образованные PGCs (маркированные белком Vasa) в эмбрионах dpp hr92 накапливают уровни pSer2, приближающиеся к уровням окружающих соматических ядер.Количественное определение pSer2-позитивных ПЗК показывает, что 23,9% ПЗК на стадии синцитиальной бластодермы dpp hr92 (n = 67; p = 0,000597 по точному критерию Фишера) и 30% (n = 120; p = 1,0e- 6 по точному критерию Фишера) tkv 427 PGCs имеют ядерный pSer2, по сравнению с 5,1% для WT PGCs (n = 98) (рис. 3 и таблица S3 и S5).

    Рис. 3. Потеря компонентов передачи сигналов BMP приводит к повышенным уровням маркера активной транскрипции в PGCs.

    (а) WT , (б) DPP HR92 HR92 , (C) TKV 427 427 , а (D) TKV M-Z + Embryos были окрашены для маркера полюсных клеток Vasa (красный) и фосфоSer2 (индикатор активации транскрипции, зеленый). Звездочки указывают на присутствие фосфоSer2 в PGCs. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g003

    Чтобы дополнительно проверить влияние пути BMP на активность РНК-полимеразы II, мы исследовали PGCs эмбрионов, отложенных матерями tkv клонов зародышевой линии ( ткв m-z+ ).В то время как PGCs в контроле дикого типа (рис. 3) лишь изредка имели обнаруживаемые уровни pSer2 (4,6%, n = 43), более сорока процентов (41,2%, n = 51) PGCs у tkv m-z+ эмбриона на стадии бластодермы имели pSer2 (таблица S5; p = 2,70e-5 по точному критерию Фишера). Более того, эти tkv m-z+ PGCs с самыми высокими уровнями pSer2 часто демонстрировали признаки истощения Vasa (каретки, рис. 3B и 3C).

    pSer2 — не единственный маркер транскрипционной активности, который изменяется в PGC, когда компоненты пути BMP не полностью активны.У WT хроматиновый маркер активной транскрипции, модификация гистона h4, h4meK4, активируется в соматических ядрах зародышей синцитиальной бластодермы, тогда как в ядрах PGC он почти полностью отсутствует. Напротив, этот маркер легко обнаруживается в tkv 427 PGCs (51,7% от tkv 427 PGCs, n = 56, PGCs, n = 56; p = 0,0 по Фишу), точно по сравнению с тестом Фиша. WT PGCs (n = 69) (S4 Fig). Кроме того, более слабое, но значительное повышение сигнала h4meK4 также наблюдалось в PGC от dpp hr92 эмбрионов (22.2%, п = 54; p = 0,001077 по точному критерию Фишера) (таблица S5). Взятые вместе, эти наблюдения предполагают, что потеря передачи сигналов BMP у ранних эмбрионов нарушает правильное подавление транскрипции в PGCs.

    Гены, обычно молчащие во вновь образованных PGC, эктопически экспрессируются, когда путь BMP скомпрометирован

    Предыдущие исследования показали, что три материнских фактора, которые, как известно, ответственны за репрессию транскрипции во вновь образованных PGCs, Gcl, Nos и Pgc, функционируют в разное время и нацелены на перекрывающийся набор генов. gcl функционирует во время целлюляризации PGC. Gcl отвечает за отключение транскрипции генов, которые активируются в минорной волне ZGA. Его мишенями являются scute ( sis-b ), sis-a и runt [11, 12]. Он также играет роль в подавлении стимулятора становления Sxl , Sxl-Pe . Pgc и Nos функционируют после образования PGC, но имеют разные активности и генные мишени. pgc ингибирует киназу pTFb, которая фосфорилирует остаток Ser2 в домене Pol II CTD.Его известные цели включают бесхвостых ( tll ) и медленных как патока ( slam) [13, 14]. Хотя неясно, как nos ингибирует транскрипцию Pol II, его известные мишени включают fushi-tarzu , даже-пропущенный и промотор Sxl-Pe [17].

    Чтобы проверить влияние компрометации передачи сигналов BMP на транскрипционную активность, мы выбрали tll , slam и Sxl-Pe и исследовали их экспрессию с использованием комбинации флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и одиночной молекулярной FISH. (смРЫБЫ).Зонды tll и slam были направлены против последовательностей в соответствующих мРНК, в то время как зонд Sxl-Pe гомологичен большому интрону в транскрипте Sxl-Pe и, таким образом, выявляет только зарождающиеся мРНК. Как показано на рис. 4, мы обнаруживаем, что мРНК tll экспрессируется в подмножестве dpp hr92 PGC (рис. 4). В то время как все эмбрионы WT не имели транскрипции tll в PGCs (n = 19), 70,4% эмбрионов dpp hr92 демонстрировали эктопическую транскрипцию tll (n = 27; p = 1.0e-6 по точному критерию Фишера). Для дальнейшего количественного определения экспрессии мРНК tll в ПЗК dpp hr92 по сравнению с WT мы нормализовали интенсивность окрашивания tll в ПЗК по отношению к соседним соматическим клеткам. Как показано на графике, наблюдается значительное увеличение среднего уровня сигнала tll в PGC dpp hr92 по сравнению с WT (рис. 4H). У эмбрионов дикого типа транскрипты slam начинают появляться на стадии синцитиальной бластодермы, и их уровни значительно повышаются у эмбрионов на стадии клеточной бластодермы.РНК slam также ассоциирует с белком Slam, декорирующим мембраны [64]. Следовательно, зонд slam , направленный против мРНК, метит расширяющийся мембранный компартмент соматических ядер/клеток. Однако slam не транскрибируется в PGC, и они обычно лишены мРНК slam . Используя smFISH, мы обнаружили экспрессию slam в подмножестве PGCs dpp hr92 (рис. 5B: см. звездочки). Примерно 26.3% эмбрионов dpp hr92 (n = 38; p = 0,000991 по точному критерию Фишера) имеют один или несколько PGCs, которые экспрессируют мРНК slam (таблица S6). Мы также исследовали PGCs у эмбрионов, несущих линию dpp RNAi dppi 33618 (рис. 5C: см. звездочки). Мы обнаружили, что 35,7% из точек на дюйм 33618 экспрессируют slam (n = 14; p = 0,000852 по точному критерию Фишера) по сравнению с 0% для эмбрионов дикого типа (n = 37).Для Sxl-Pe частота эмбрионов dpp hr92 , которые имеют обнаруживаемые транскрипты, ниже, чем для tll и slam . Мы обнаружили, что 18,2% эмбрионов dpp hr92 (n = 11; p = 0,47619 по точному критерию Фишера) имеют Sxl-Pe транскриптов, в то время как Sxl-Pe T транскриптов эмбрионов не наблюдаются. (n = 10) (таблица S6). Кажется вероятным, что мы гораздо реже обнаруживаем транскрипты Sxl-Pe в dpp hr92 PGC, потому что зонд Sxl-Pe гибридизуется только с зарождающимися транскриптами, а всплески транскрипции относительно редки.Кроме того, мы обнаружили, что эктопическая экспрессия Sxl-Pe действительно показывает небольшую предвзятость по полу у эмбрионов gcl [12]. Аналогичная систематическая ошибка может сделать обнаружение транскриптов Sxl относительно более редким по сравнению с неспецифическими по полу соматическими генами (например, slam , tll ).

    Рис. 4. dpp -скомпрометированные эмбрионы демонстрируют PGC-специфическую аберрантную транскрипцию терминального паттернирующего гена бесхвостого ( tll ). Эмбрионы

    (A-C) WT и (D-G) dpp hr92 были одновременно окрашены на Vasa (красный) и исследованы на РНК tll (зеленый) с использованием FISH.Ядра метили с помощью Hoescht (белый/синий). На панелях E и G показаны увеличенные области панелей D’ и F’ соответственно. Масштабная линейка представляет 10 мкм. H) На приведенном ниже графике показано нормализованное значение плотности транскриптов tll в PGCs по отношению к соме у того же эмбриона (подробности количественного определения см. в разделе «Материалы и методы»).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g004

    Рис. 5. PGCs из dpp -скомпрометированных эмбрионов демонстрируют эктопическую экспрессию гена соматической целлюляризации медленно, как патока ( slam ) в PGCs .

    Smishfish был выполнен с использованием зондов, специфичных для SLAM (красный) на (A / C) EGFPI , (B) DPP HR92 , а (D) DPPI 33618 Embryos . Ядра были помечены с помощью Hoescht (синий). Звездочками выделены ядра PGC в dpp -компрометированных эмбрионах, экспрессирующих РНК slam . Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g005

    Скомпрометированная передача сигналов BMP коррелирует с неправильным распределением компонентов полярной плазмы

    При анализе PGCs у эмбрионов, скомпрометированных для передачи сигналов BMP, мы отметили, что белок Vasa не всегда был полностью секвестрирован во вновь образованных PGCs (S5 Fig, caret).Это заставило нас задаться вопросом, были ли дефекты в распределении компонентов полярной плазмы во время формирования PGC. Чтобы исследовать эту возможность, мы использовали Smisfish для изучения локализации двух полюсов плазма MRNAS, PGC и GCL , в DPP HR92 и DPPI и 33618 Embryos. На рис. 6 показаны проекции максимальной интенсивности pgc мРНК у эмбрионов дикого типа ( egfpi ), dpp hr92 и dppi 584 0361584 эмбрионов.У контрольных эмбрионов мРНК pgc эффективно встраивается в PGCs, когда они целлюляризуются, и почти не проникает в окружающую сому (Fig. 6A). В противоположность этому, в обоих ДПП hr92 и DPPI 33618 доклеточными эмбрионов бластодерму, введение PGC мРНК в PGCs кажется менее эффективным, и PGC мРНК наблюдается в окружении сома, где она связана с соматическими ядрами (рис. 6В и 6С).Неспособность должным образом секвестрировать мРНК pgc во вновь образованных PGC документирована на графиках отдельных эмбрионов (Fig. 6D). мРНК gcl также не захватывается эффективно PGCs в dpp hr92 и dppi 33618 .

    Рис. 6. Потеря dpp приводит к распространению компонента полярной гранулы РНК зародышевой плазмы ( pgc ) от заднего полюса.

    Smishfish был выполнен с использованием зондов, специфичных для PGC (зеленый) на 0-4 HR Paraformaldehyde — фиксированный (а) EGFPI (б) DPP HR92 и (C) DPPI 33618 эмбриона.Ядра были помечены с помощью Hoescht (синий). Показанные изображения являются репрезентативными проекциями максимальной интенсивности. Масштабная линейка представляет 10 мкм. (D) Профили участка, показывающие неправильную локализацию полярной плазмы (визуализируется с помощью pgc ) от задней крышки (подробности количественной оценки см. в разделе «Материалы и методы»).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g006

    Дефекты секвестрации компонентов полярной плазмы во время формирования PGC могут возникать из-за дефекта закрепления РНК и белков полярной плазмы в задней коре и/ или преждевременное высвобождение этих факторов.Такие дефекты должны быть очевидны у пресинцитиальных эмбрионов до миграции ядер в полярную плазму. Чтобы оценить эту возможность, мы проанализировали локализацию РНК pgc и gcl у молодых эмбрионов до формирования полюсных клеток. В отличие от более поздних стадий, мы обнаружили, что мРНК pgc и gcl тесно связаны с задней корой у всех молодых эмбрионов до образования полюсной почки (n = 5 для каждого генотипа; S6 Fig). Взятые вместе, эти данные доказывают, что передача сигналов BMP необходима для правильной секвестрации компонентов полюсной плазмы в PGCS на этапе во время или, что более вероятно, после высвобождения полярной плазмы с задней поверхности коры.

    Передача сигналов BMP необходима для подавления функционирования терминального пути

    Одним из характерных фенотипов эмбрионов от мутантных матерей gcl является неспособность должным образом секвестрировать компоненты полярной плазмы во время целлюляризации PGC. Как видно, когда экспрессия Dpp нарушена, мРНК pgc и белок Vasa неправильно включаются в мутантные PGC gcl [12]. Неспособность должным образом секвестрировать полюсную плазму во время образования PGC, по-видимому, обусловлена, по крайней мере частично, несоответствующей активацией терминального сигнального пути у мутантов gcl .Исследования Пае и др. . (2017) [65] показали, что Gcl нацелен на рецептор терминального пути Torso для протеолитической деградации, тем самым закрывая путь на самом заднем полюсе эмбриона. Когда терминальный сигнальный каскад активируется на заднем полюсе либо у мутантов gcl , либо в результате мутаций с усилением функции в рецепторе Torso или его нижестоящих киназах, компоненты плазмы полюса не включаются должным образом в PGCs, когда они целлюляризуются [12]. . Эти наблюдения повышают вероятность того, что путь BMP может быть необходим для подавления терминального сигнального пути.Чтобы проверить это напрямую, мы исследовали эмбрионы WT и dpp hr92 с антителами против дифосфорилированной формы нижестоящей киназы ERK, dpERK, которая использовалась в качестве диагностического маркера активации пути. WT PGCs имеют очень мало dpERK, если они вообще есть. Напротив, PGCs у эмбрионов dpp hr92 накапливают легко обнаруживаемые уровни dpERK (S7 Fig). Мы обнаружили, что 66,0% (n = 47; p = 0,0 по точному критерию Фишера) ПЗК на стадии синцитиальной бластодермы dpp hr92 эмбрионов имеют dpERK, в то время как dpERK обнаружен только у 9.8% PGC эмбрионов дикого типа на эквивалентной стадии (n = 51).

    Активация терминального пути в задней части вызывает потерю сосудов

    Присутствие dpERK в PGCs при нарушении сигнального пути BMP указывает на то, что одной из его функций в спецификации PGC является подавление терминальной передачи сигналов. Чтобы предоставить дополнительные доказательства этой связи, мы исследовали накопление Vasa в PGCs, в которых терминальный сигнальный путь был эктопически активирован. С этой целью мы использовали активируемый светом SOS-белок optoSOS для включения терминального пути на заднем полюсе эмбриона [66, 67].На рис. 7 показано, что уровни белка Vasa в PGC существенно снижаются после активации optoSOS . Количественная оценка среднего уровня Vasa у WT (n = 30) и optoSOS (n = 41) позднесинцитиальных и клеточных зародышей бластодермы указывает на почти двукратное снижение после световой активации. Этот вывод, взятый вместе с предыдущими исследованиями ( 67 ), которые показали, что мРНК pgc и gcl не включаются должным образом в PGC, если только терминальный сигнальный путь не отключается во время их целлюляризации, обеспечивает дополнительную поддержку идеи, что это путь является важной мишенью для сигнального пути BMP в спецификации PGC.С другой стороны, кажется вероятным, что терминальный путь является не единственной мишенью BMP: мы обнаружили, что накопление dpERK либо за счет оптогенетической активации, либо за счет экспрессии конститутивно активной формы восходящей киназы не приводит к неадекватной и/или преждевременной активации соматические гены-мишени, такие как tll [68].

    Рис. 7. Оптогенетическая активация передачи сигналов ERK в задней части эмбриона приводит к потере Vasa из PGCs.

    Фиксированные параформальдегидом и экспонированные синим светом (A) WT (n = 30) и (B) OptoSOS (n = 41) Эмбрионы NC12-14 окрашивали на маркер полюсных клеток Vasa (белый).Показанные изображения являются репрезентативными проекциями максимальной интенсивности. Масштабная линейка представляет 10 мкм. (C) Были измерены нормализованные общие интенсивности Vasa. Красная линия показывает среднее значение, красная рамка указывает на 95% доверительный интервал, а синие линии указывают на стандартное отклонение (подробности количественного определения см. в разделе «Материалы и методы»).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g007

    Потеря

    dpp приводит к преждевременной инвазивной миграции PGCs

    Известно, что гиперактивация терминального пути у позднесинцитиальных или ранних клеточных эмбрионов бластодермы вызывает необычное изменение поведения PGCs.Вместо того, чтобы оставаться прикрепленными друг к другу в виде монослоя на поверхности эмбриона, часть PGCs теряет адгезию и начинает проникать в нижележащую сому. Так как потеря передачи сигналов BMP индуцирует фосфорилирование ERK в PGCs, можно было бы ожидать наблюдения доказательств инвазивной миграции. Как показано в таблице S7, инвазивная миграция наблюдается лишь изредка у эмбрионов dpp hr92 . Инвазивные PGC наблюдались только у 13,3% из дпп ч92 эмбрионов (таблица S7; p = 0.484127 по точному критерию Фишера). С другой стороны, в случае сильного аллеля гипоморфа, dpp 4 , инвазивная миграция наблюдалась почти у половины эмбрионов dpp 4 (рис. 8 и таблица S7, p = 0,014907 по точному критерию Фишера).

    Рис. 8. Потеря функции dpp приводит к инвазивной миграции и отсутствию прилегания ПЗК.

    0–4 ч, фиксированный параформальдегидом (A) osk/+ (B/C) dpp hr92 /+;osk/+ (D) 4pp 9 9 905 8 d 4 эмбрионов окрашивали на Vasa (AE, зеленый) и Twist (DE, красный).Звездочки показывают распространение PGCS / отсутствие приверженности в DPP HR92 / +; OSK / + Embryos в то время как Carets выделены инвазивные миграции в DPP HR92 / + ;; OSK / + и дпп 4 эмбрионов. Изображения являются репрезентативными проекциями максимальной интенсивности. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g008

    Доминирующие генетические взаимодействия между

    osk и dpp

    Наши результаты демонстрируют, что ранние этапы спецификации PGC нарушаются, когда нарушается функционирование сигнального пути BMP.Факторы, важные для процесса спецификации, не разделяются должным образом во вновь образованные PGC, и критические шаги в установлении идентичности PGC, такие как закрытие терминального пути и установление покоя транскрипции, нарушаются. Также известно, что эти этапы зависят от гена osk , который кодирует материнскую детерминанту, которая управляет сборкой полюсной плазмы на поздних стадиях оогенеза [44, 45]. В этом случае можно ожидать, что будут синергетические генетические взаимодействия между osk и путем BMP, даже если их критические функции необходимы в разных контекстах — osk у матери и передача сигналов BMP в зиготе.

    Чтобы проверить это предсказание, мы уменьшили активность osk у матери и передачу сигналов BMP в зиготе путем спаривания osk A87 /+ гетерозиготных матерей до dpp hr hrs Все эмбрионы, полученные от этого скрещивания, т.е. « dpp hr92 /+; osk /+» имеют ген WT dpp , трансформированный в гипоморфный (и гомозиготный жизнеспособный) аллель dpp hr92 .В качестве контроля использовали эмбрионы, полученные от матерей osk A87 /+ ( osk/+ ), скрещенных с самцами дикого типа. Мы ожидали, что если передача сигналов dpp функционирует в сотрудничестве с osk -зависимым путем спецификации, одновременное снижение активности обоих может влиять на процесс формирования и/или спецификации.

    Мы не нашли доказательств того, что формирование PGC было изменено в dpp ч92 /+; osk /+ эмбрионов.Среднее количество PGCs, наблюдаемых в dpp hr92 /+; osk /+ существенно не отличался от osk osk /+. Цикл 14 dpp hr92 /+; Эмбрионы osk /+ имели 11,7 PGC (n = 49), в то время как эмбрионы osk /+ имели 11,1 PGC (n = 37) (таблица S8; p = 0,49 по t-критерию).

    Несмотря на то, что формирование PGC было нормальным, в спецификации были обнаружены дефекты. В то время как накопление и распределение Vasa нарушено как в osk /+, так и в dpp hr92 /+ ; osk /+, частота дефектов больше у dpp hr92 /+ ; или /+ (фиг. 8А, 8В и 8С).В эмбрионах osk /+ 42,3% (n = 26) имели сниженный уровень Vasa, в то время как в эмбрионах dpp hr92 /+;osk /+ снижение уровня Vasa было очевидным у 69,2% ( n = 26) PGC (таблица S9; p = 0,0 по точному критерию Фишера). Потеря Vasa, вероятно, связана, по крайней мере частично, с неспособностью должным образом сегрегировать компоненты зародышевой плазмы в PGCs во время процесса целлюляризации. В этом случае мы ожидаем наблюдать аберрантную локализацию других компонентов зародышевой плазмы в окружающей соме.На рис. 9 показана локализация мРНК pgc в эмбрионах osk /+ и dpp hr92 /+;osk/+ . Эффективность включения pgc мРНК в osk /+ PGCs в этом эксперименте (фиг. 9A, 9C и 9E) оказывается сходной с WT (фиг. 6A). Напротив, мРНК pgc не захватываются должным образом PGCs у эмбрионов dpp hr92 /+;osk /+ (Fig 9B, 9D и 9F) и вместо этого распространяются в сому.Чтобы расширить эти наблюдения, мы одновременно гибридизировали эмбрионы osk /+ и dpp hr92 /+; osk /+ с зондами мРНК slam и pgc . Как показано на фиг. 10B и 10D, pgc мРНК связаны с соматическими ядрами, которые экспрессируют slam мРНК (см. звездочки). В этом эксперименте мы также время от времени наблюдали pgc мРНК, связанные с соматическими ядрами, экспрессирующими slam мРНК, у контрольных эмбрионов osk /+ (фиг. 10A и 10C, знак вставки)).Однако это происходит гораздо реже, что указывает на то, что неправильная локализация мРНК pgc значительно усугубляется умеренным снижением активности dpp .

    Рис. 9. Одновременная компрометация материнского и зиготического уровней oskar и dpp соответственно приводит к аберрантной локализации зародышевой плазмы.

    smFISH был выполнен с использованием зондов, специфичных для pgc (зеленый) на 0–4 ч, фиксированном параформальдегидом (A/C) osk/+ и (B/D) dpp hr92 4 + osk/+ эмбриона для оценки распространения полярной плазмы сзади.Изображения являются репрезентативными проекциями максимальной интенсивности Масштабная линейка соответствует 10 мкм. (EF) Профили участков показывают неправильную локализацию полюсной плазмы (визуализируется с помощью pgc ) вдали от задней крышки (подробности количественного определения см. в разделе «Материалы и методы»). На каждом графике показан репрезентативный эксперимент, где каждая линия изображает полюсное распределение плазмы отдельного эмбриона.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g009

    Рис. 10. Аберрантно переданная РНК pgc колокализуется с соматическим маркером, slam при одновременной компрометации oskar и 4pp.

    smFISH был выполнен с использованием зондов, специфичных для pgc (зеленый) и slam (пурпурный) на 0–4 ч, фиксированном параформальдегидом (A/C) osk/+ и (B/D) dpp hr92 /+;osk/+ эмбрионов для оценки распространения полярной плазмы сзади. Карет указывает, что некоторые соматические ядра подвергаются воздействию pgc у osk/+ эмбрионов. Звездочка подчеркивает более серьезную неправильную локализацию pgc и перекрытие сигналов pgc и slam у dpp hr92 /+;osk/+ эмбрионов.Изображения являются репрезентативными проекциями максимальной интенсивности Масштабная линейка соответствует 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.g010

    После образования ПЗК и их первоначальной спецификации они остаются слипшимися друг с другом и группируются в относительно однородный монослой, покрывающий задний полюс синцитиальной и клеточной бластодермы. эмбрионы. Хотя это верно и для большинства контрольных эмбрионов osk /+, мы наблюдали поразительные дефекты группировки PGC на заднем полюсе у эмбрионов dpp hr92 /+; osk /+, предположительно из-за потери адгезии (рис. 8B и S8).56,7% этих эмбрионов (n = 78; p = 0,000151 по точному критерию Фишера) имеют один или несколько ЗПК, которые отделены от заднего скопления ЗПК, по сравнению с немногим более четверти эмбрионов из osk /+. (26,7% (n = 75)) (таблица S10). Помимо отсутствия кластеризации, dpp hr92 /+;osk /+ PGCs не всегда остаются на поверхности эмбриона. Вместо этого они начинают вторгаться в основную сому. Пример инвазивной миграции PGCs у эмбрионов dpp hr92 /+;osk /+ показан на рис. 8C.Инвазивный фенотип наблюдался у 38,5% (n = 78; p = 0 по точному критерию Фишера) из dpp hr92 /+;osk /+ эмбрионов. Для сравнения, инвазивные PGC были обнаружены только у 5,3% из osk /+ контрольных эмбрионов (n = 75) (таблица S10).

    Обсуждение

    Drosophila melanogaster — один из классических и наиболее изученных примеров организмов, использующих механизм «преформации» для спецификации ПГК [1].Одно из первых указаний на то, что PGCs у мух специфицируются преформированием, было получено почти 100 лет назад в экспериментах, в которых детерминанты зародышевой линии инактивировались УФ-облучением задней части эмбриона [69-71]. Существование локализованных и чувствительных к УФ-излучению детерминант впоследствии было подтверждено экспериментами по трансплантации. Окада и др. . показали, что стерильность эмбрионов, облученных УФ-излучением, может быть восстановлена ​​инъекцией цитоплазмы необлученных эмбрионов в заднюю область эмбрионов, обработанных УФ-излучением [72].Важно отметить, что они обнаружили, что спасательная активность локализована внутри донора; он присутствует на заднем, но не на переднем полюсе. В дополнительных экспериментах было обнаружено, что цитоплазма из заднего полюса индуцирует PGCs при введении в передний [43]. Более того, эти эктопические PGCs были способны генерировать функциональную зародышевую линию при повторной инъекции в задний полюс реципиентов с аналогичной стадией. Последующие эксперименты показали, что как для формирования PGC, так и для формирования абдоминального паттерна необходимы гены, активные у матери во время оогенеза, и что ключевой материнский фактор для формирования полюсной плазмы кодируется osk [41, 42, 44, 73].Эктопическая локализация мРНК osk , сконструированная путем связывания ее с bcd 3′ UTR, достаточна для сборки полярной плазмы в передней части ооцита [44]. У доклеточных эмбрионов бластодермы плазма эктопического полюса индуцирует образование PGCs на переднем конце. Более того, как впервые наблюдали Illmensee и Mahowald [43], эти PGCs способны заселять взрослую зародышевую линию при трансплантации в заднюю часть реципиентных эмбрионов.

    Хотя эти и др. исследования [45] ясно демонстрируют, что материнские детерминанты, локализованные на заднем полюсе эмбриона мухи, управляют спецификацией PGC, они не устанавливают, что этот механизм является исключительно преформацией.Существует потенциально важное предостережение в связи с экспериментами, показывающими, что PGCs, индуцированные в передней части (либо инъекцией полюсной плазмы, либо osk bcd 3′ UTR), способны генерировать функциональную взрослую зародышевую линию: эктопические PGCs были трансплантируются в заднюю часть эмбрионов-реципиентов и, таким образом, подвержены почти той же среде, что и PGC, образующиеся нормальными механизмами. Это оставляет открытой возможность того, что эпигенез может играть роль в спецификации PGC. Чтобы решить эту проблему, мы задались вопросом, участвует ли сигнальный путь BMP в спецификации PGCs мух, когда они образуются во время доклеточных стадий бластодермы эмбриогенеза.Мы выбрали этот путь по четырем причинам. Во-первых, известно, что этот путь функционирует в спецификации PGC у животных, зависящих от эпигенеза [1]. Во-вторых, хотя экспрессия dpp в зиготе ограничена дорсальной стороной эмбриона с помощью Dorsal морфогена, как in situ гибридизация , так и эксперименты по окрашиванию антителами показывают, что экспрессия dpp охватывает весь задний полюс [56]. В-третьих, эксперименты Dorfman и Shilo показали, что активатор транскрипции, pMad, индуцируемый в принимающих клетках сигнальным путем BMP, присутствует в ядрах доклеточных PGCs бластодермы [52].Причем накопление pMad зависит не только от лиганда Dpp, но и от материнских зиготических источников и рецептора Tkv. Наконец, в предыдущих исследованиях мы обнаружили, что передача сигналов BMP необходима для поддержания идентичности PGC и их дифференцировки в середине эмбриогенеза в период, предшествующий слиянию эмбриональных гонад [50].

    Наши результаты показывают, что материнских детерминант самих по себе недостаточно для надлежащей спецификации PGCs и что этот процесс не является исключительно клеточно-автономным, как долгое время считалось.Вместо этого используется гибрид преформации и эпигенеза для создания полного набора функциональных PGCs. Мы находим, что когда путь BMP нарушается у доклеточных эмбрионов бластодермы, вновь образованные PGC обнаруживают множество дефектов, указывающих на неудачу в определении PGC. Более того, такие же фенотипы наблюдаются в PGCs у эмбрионов, чьи матери мутантны по одному или более из трех материнских факторов, gcl , pgc и nos , которые, как известно, необходимы для правильной спецификации PGC.Стоит также отметить, что в наших экспериментах функционирование пути BMP не было полностью нарушено. Т.о., остается открытой возможность того, что более драматические или даже некоторые дополнительные фенотипические эффекты могут наблюдаться в условиях, когда передача сигналов BMP полностью отсутствовала у доклеточных эмбрионов бластодермы. (Например, активность dpp может влиять на целлюляризацию PGC. Также будет интересно оценить, является ли заякоривание полярной плазмы полностью нормальным у пребластодермальных эмбрионов, если путь BMP скомпрометирован).

    В наблюдаемые дефекты включены частичная потеря белка Vasa, неспособность подавлять фосфорилирование Ser2 CTD, изменения в профиле модификаций гистонов и фосфорилирование терминального (и EGFR) белка ERK сигнального пути. В PGC WT фосфорилирование Ser2 в домене CTD большой субъединицы PolII с помощью pTfb блокируется белком Pgc [13-15]. Этот блок преодолевается у эмбрионов, гомозиготных по частичной утрате функции аллеля dpp hr92 , и у эмбрионов, полученных от матерей-клонов зародышевой линии tkv .Более того, две из известных мишеней для репрессии Pgc, tll и slam , экспрессируются в dpp hr92 PGCs. Однако неправильное функционирование Pgc — не единственный дефект в установлении покоя транскрипции. Мы также наблюдали активацию промотора становления Sxl , Sxl-Pe . Предыдущие исследования показали, что транскрипция Sxl-Pe неправильно включается в PGCs в потомстве матерей gcl и nos , но не в потомстве матерей pgc [12, 13, 17].Т.о., компрометация передачи сигналов BMP, по-видимому, широко влияет на покой транскрипции, приводя к неправильной экспрессии генов, обычно репрессируемых в PGCs под действием нескольких разных факторов. В случае tll , например, Pgc не является единственным компонентом полярной плазмы, который, как предполагается, играет роль в его репрессии. Транскрипция tll активируется в соматических ядрах на переднем и заднем концах эмбриона по терминальному пути. Однако терминальный путь обычно отключается в PGC WT белком Gcl, который опосредует деградацию рецептора Torso [65].Функция gcl также должна быть нарушена прямо или косвенно, когда нарушается сигнальный путь BMP, поскольку мы обнаружили, что dpERK накапливается в ядрах PGC, как и у мутантов gcl .

    Это не единственные связи между путем BMP, Gcl и терминальным сигнальным путем. У эмбрионов gcl компоненты полярной плазмы (включая Vasa и pgc ) не захватываются должным образом PGCs при их целлюляризации. Вместо этого они распространяются в заднюю область эмбриона и обнаруживаются связанными с соматическими ядрами.Аналогичное нарушение в правильном распределении полярной плазмы во время целлюляризации PGC было обнаружено, когда терминальный путь активировался путем блокирования деградации Torso или конститутивным аллелем нижестоящей киназы MEK [12]. Более того, как показано здесь, мы обнаружили, что Vasa теряется из PGCs, когда терминальный путь оптогенетически активируется в задней части эмбриона. Фактически, фенотип потери Vasa, индуцированный оптогенетической активацией SOS, очень похож на тот, что наблюдался, когда мы нарушали путь BMP нокдауном RNAi мутантов dpp и мутантов dpp и tkv .Взятые вместе, эти находки доказывают, что одной из функций пути BMP в спецификации PGC является блокирование терминального сигнального пути. В этом контексте интересно отметить, что ингибирование EGFR-зависимой передачи сигналов может быть важным для спецификации PGC у млекопитающих. Когда клетки ESC культивируют в условиях, которые способствуют образованию клонов мезодермы, PGC-подобную идентичность можно индуцировать путем добавления ингибитора вышележащей киназы MEK в культуральную среду [74].

    У мух существует сложная взаимосвязь между сигнальными путями BMP и EGFR.В случае Torso-зависимого терминального пути фосфорилирование dpERK Capicua в передней и задней части сомы противодействует репрессии dpp с помощью Dorsal [75, 76]. В других контекстах развития отношения между передачей сигналов BMP и родственным путем EGFR сложны. В крыловом диске, например, передача сигналов BMP и EGFR, как сообщается, устанавливает петлю положительной обратной связи, усиливая друг друга, способствуя синтезу их соответствующих лигандов [77]. Однако в других контекстах взаимодействия между двумя путями различны.Полногеномные исследования формирования дорсовентрального паттерна во время эмбриогенеза показывают, что передача сигналов BMP как отрицательно, так и положительно регулирует экспрессию компонентов сигнального пути EGFR во время эмбриогенеза [78]. EGFR, в свою очередь, было предложено сдерживать, а не усиливать путь BMP за счет dpERK-зависимого фосфорилирования dSmad, что приводит к его деградации. В исследованиях формирования паттерна глазного поля и эпидермиса головы у Drosophila , Chang et al . также предположили антагонистическую связь между передачей сигналов BMP и EGFR [79].Было обнаружено, что высокие уровни Dpp блокируют передачу сигналов EGFR путем ингибирования накопления dpERK, в то время как мутанты с усилением функции EGFR подавляют передачу сигналов Dpp. Хотя механизм ингибирования накопления dpERK не был раскрыт, тот же самый механизм может быть использован для блокирования активации терминального пути во время спецификации PGC у доклеточных эмбрионов бластодермы. Альтернативно, механизм ингибирования может быть специфичным для процесса спецификации PGC. Например, исследования Пае и др. .(2017) предположили, что деградация Torso с помощью Gcl сама по себе должна быть достаточной для устранения как канонической, так и неканонической активности терминального сигнального пути в PGCs [65]. Т.о., возможно, что путь BMP может ингибировать терминальную передачу сигналов путем потенцирования активности Gcl прямо или косвенно.

    То, что сигнальный путь BMP необходим для правильного функционирования отложенных от матери компонентов полярной плазмы во время спецификации PGC, также подтверждается доминирующими генетическими взаимодействиями между osk и dpp .В этих экспериментах самок, гетерозиготных по мутации osk , скрещивали с самцами, несущими слабый жизнеспособный аллель dpp , dpp hr92 . Уменьшение дозы osk у матери само по себе, по-видимому, приводит к незначительному нарушению секвестрации полярной плазмы у ее потомства; однако этот дефект существенно усиливается, когда потомство также гетерозиготно по dpp hr92 . В дополнение к неспособности полностью захватить полюсную плазму, dpp hr92 /+;osk/+ PGCs обнаруживают другие аномалии, включая новую потерю межклеточной адгезии и инвазивную миграцию.Это синергетическое взаимодействие подтверждает, что путь BMP сотрудничает с osk в процессе спецификации PGC и при этом служит для интеграции преформирования с эпигенезом.

    Тот факт, что одна из классических моделей преформации задействует сигнальный путь, который, как известно, играет критическую роль в спецификации PGC у видов, зависящих от эпигенеза, по-видимому, подтверждает аргумент о том, что эпигенез является наследственным способом для создания этой особой клеточной идентичности. .Эта точка зрения подтверждается эволюционной историей osk и nos , генов, которые функционируют автономно в клетке в спецификации PGC у мух. Первый ограничен подмножеством насекомых, которые используют преформацию в спецификации PGC, и считается, что он возникает в результате слияния бактериальных и эукариотических последовательностей [80]. , напротив, сохраняется от червей до человека и охватывает виды, которые классически идентифицируются как использующие либо преформацию, либо эпигенез для спецификации PGC.

    Материалы и методы

    Поголовье мух и генетика

    Для анализа, представленного в этой рукописи, использовались следующие запасы мух. белый 1 ( w 1 ) использовался в качестве запаса WT. Рекомбинантный штамм dpp 4 twi был получен от Eric Wieschaus. линии egfp RNAi (BDSC № 41552), линии dpp RNAi (BDSC № 33618 или 25782) и UAS-dpp (BDSC № 1486) приводились в действие приводным приводом twi-GAL4 (BDSC № 2517). или материнский-тубулин-GAL4 ( 67 . 15 ) набор драйверов, который содержит 4 экземпляра материнский тубулин-GAL4 (получен от Эрика Вишауса). Передача сигналов BMP также была скомпрометирована с помощью dpp hr92 (BDSC #2069), tkv 427 (получен от Kristi Wharton) или FRTtkv

    4 8

    4

    4 со склада.

    osk A87 акции были подарком Лиз Гэвис.

    Для окрашивания эмбрионов мы использовали белых 1 эмбрионов в качестве контроля в большинстве случаев.Везде, где эксперимент включал стратегию нокдауна RNAi, мы получили egfpi эмбрионов путем скрещивания материнских тубулинов-GAL4 девственниц с UAS egfpi самцов и использовали их в качестве контроля.

    Иммуноокрашивание

    Эмбрионы фиксировали формальдегидом и использовали стандартный иммуногистохимический протокол для флуоресцентного или DAB-визуализированного иммунного окрашивания, как описано ранее [17]. В качестве первичных антител использовали кроличьи анти-Vasa (1:2000; дар Пола Ласко), крысиные анти-Vasa (1:1000; дар Пола Ласко), кроличьи анти-ph4 (1:1000; Upstate Biotechnology), кроличьи анти-Vasa (1:1000; -CycB (1:500; подарок Джордана Раффа), мышиный анти-H5 для обнаружения pSer2 (1:250; Research Diagnostics, Inc.), h4meK4 (1:500; дар К. Дэвида Эллиса), крысиный анти-Twist (1:500; дар Эрика Вишауса), кроличий анти-dpERK (1:100; Cell Signaling Technology), овечий анти-GFP ( 1:1000; Bio-Rad), овечий антидигоксигенин (DIG) (1:125; Roche) и мышиный антибиотин (1:125; Jackson Immunoresearch). При флуоресцентном иммуноокрашивании использовали вторичные антитела Alexa-Fluor в соотношении 1:500 (ThermoFisher), а ДНК метили с использованием DAPI (10 нг/мл, ThermoFisher Scientific) или Hoescht (3 мкг/мл, Invitrogen). Для окрашивания DAB использовали вторичные антитела к пероксидазе хрена (HRP) (Jackson Immunoresearch) в соотношении 1:1000.Окрашенные эмбрионы монтировали с помощью Aqua Poly/mount (Polysciences) на предметные стекла. Для каждого эксперимента использовали не менее трех независимых биологических повторов.

    Флуоресценция

    in situ гибридизация (FISH) и одиночная молекула FISH (smFISH)

    FISH выполняли, как описано ранее, с использованием зондов, специфичных для tll [68]. Для количественной оценки уровней от до мы использовали внутренний контроль в каждом эмбрионе для нормализации интенсивности. Используя ImageJ, мы измерили и усреднили интенсивность трех случайно выбранных PGC, а также собрали усредненную интенсивность из трех измерений на эмбрион в соматических клетках, положительных на бесхвостых .Нормализация была выполнена в соответствии со следующим: нормализованная интенсивность = средняя интенсивность от PGCs / усредненная интенсивность от соматических клеток . Эта нормализация была сделана для каждого состояния отдельно. Эти нормализованные интенсивности для отдельных эмбрионов были нанесены на график и представлены на рис. 4.

    smFISH выполняли, как описано ранее, с использованием фиксированных формальдегидом эмбрионов [12]. Все наборы зондов были сконструированы с использованием конструктора зондов Stellaris (20-нуклеотидные олигонуклеотиды с интервалом в 2 нуклеотида). pgc и gcl , зонды smFISH (связанные либо с красителем atto565, либо с atto647, Sigma) были подарком от Liz Gavis. Интронные зонды Sxl-Pe (связанные с красителем atto565) были подарком Томаса Грегора, а зонды slam (связанные с Quasar 670) были произведены Biosearch Technologies. Все образцы монтировали с помощью Aqua Poly/mount (Polysciences) на предметные стекла. Для каждого эксперимента использовали не менее трех независимых биологических повторов.

    Оптогенетическая активация ERK

    контрольных эмбриона OptoSOS и Hist-GFP WT собирали в темноте в течение 2 часов, а затем стимулировали синим светом.Стимуляция синим светом проводилась при мощности ~1 мВт/см2 при 450 нм в течение 2 часов с использованием изготовленной на заказ панели из 30 светодиодов, размещенных на расстоянии ~5 см от эмбрионов и заключенных в фольгу. После стимуляции контрольные эмбрионы Hist-GFP WT и эмбрионы OptoSOS немедленно объединяли, декоронировали и помещали в фиксатор. Во время фиксации эмбрионы оставались в синем свете в течение 10 минут, чтобы обеспечить постоянную активацию. После фиксации эмбрионы окрашивали на Vasa. Z-стеки были взяты из эмбрионов NC12-14 (WT n = 30, OptoSOS n = 41). Изображения были обработаны в MATLAB, кластеризация k-средних с 4 бинами была применена к изображениям Vasa с максимальной проекцией для сегментации vasa-положительных клеток (с использованием наивысшего бина).Фоновое окрашивание эмбриона рассчитывали, используя среднюю интенсивность двух средних ячеек. Этот фон вычитали из средней интенсивности сегментированных ваза-положительных клеток. Эти средние значения были рассчитаны для каждого эмбриона в группах оптогенетиков и hist-GFP перед нормализацией обоих средних по среднему значению группы hist-GFP.

    Микроскопия и анализ изображений

    Микроскоп

    NIKON-Microphot-SA был использован для захвата изображений эмбрионов, окрашенных DAB (40X). Визуализация для всех других экспериментов smFISH и флуоресцентного иммунного окрашивания выполнялась на инвертированном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon A1.

    Изображения были собраны с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH) и Adobe Photoshop и Illustrator для обрезки интересующих областей, регулировки яркости и контрастности, создания проекций максимальной интенсивности, а также разделения или объединения каналов. Чтобы оценить неправильную локализацию РНК или белка в разных генетических фонах по сравнению с контролем, мы создали профили участков с помощью ImageJ. Самые задние 75 мкм каждого эмбриона были нанесены на график для сравнения, а эмбрионы из одной биологической реплики нанесены на рисунки, учитывая, что различия между флуоресценцией между повторами скрывали тенденции распределения полюсной плазмы, если эмбрионы из всех повторов были нанесены на график вместе.

    Статистический анализ

    Используя эмбрионы NC13/14, PGCs каждого генотипа подсчитывали от 1-й Vasa-положительной клетки до последней по всему z-объему, захваченному с интервалом в 2 микрона. Эти подсчеты PGC были проанализированы с использованием t-критерия Стьюдента. Такой же анализ применяли при подсчете ph4- или CycB-позитивных PGCs в отдельных эмбрионах в экспериментах по усилению функции dpp .

    Для сравнения числа ПЗК с высоким или низким уровнем перечисленных маркеров (Vasa, pSer2, h4meK4, dpERK) во всех идентифицируемых ПЗК каждого эмбриона подсчитывали положительные или отрицательные значения ПЗК по каждому маркеру.Различия в уровнях маркеров были постоянными, и PGC можно было легко отнести к каждой категории. Отдельные PGC подсчитывали, просматривая каждый срез Z-стека и классифицируя каждую клетку (просматривая все соответствующие срезы), а попарные сравнения этих популяций для каждого генотипа выполняли с использованием точного критерия Фишера. Для экспериментов FISH/smFISH подсчитывали общее количество эмбрионов, экспрессирующих tll , slam или Sxl-Pe в ПЗК, и использовали точный критерий Фишера для проверки значимости сравниваемых пропорций эмбрионов, положительных на транскрипцию в ПЗК. .Аналогичным образом пропорции эмбрионов, демонстрирующих аберрантное поведение PGC (отсутствие адгезии/инвазии), сравнивали с контрольными эмбрионами с использованием точного теста Фишера. Данные были нанесены на график, и статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения Microsoft Excel или R Project.

    Вспомогательная информация

    S1 Рис.

    dpp Эмбрионы с усилением функции имеют увеличенное количество PGCs.

    0–4 ч, фиксированный параформальдегидом (A/C) twi-Gal4 (B/D) или twi-Gal4/UAS-dpp эмбрионы стадии 4 (AB) или стадии 5 (CD) были окрашены для определения полюса клеточный маркер Vasa (красный) для оценки количества полюсных клеток и их пролиферации.Звездочки обозначают дополнительные деления. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s001

    (JPG)

    S2 Рис. PGCs из

    dpp эмбрионов с усилением функции увеличены в количестве, но сохраняют транскрипционный покой.

    0–4 часа, фиксированные параформальдегидом (A) twi-Gal4 (B) или twi-Gal4/UAS-dpp Эмбрионы окрашивали на маркер полярных клеток Vasa (красный) и фосфоSer2 (активация транскрипции, зеленый).Звездочка указывает на избыточное деление, проявляющееся большим количеством Vasa-позитивных клеток. Carets показывает отсутствие pSer2 в PGCs, что указывает на покой транскрипции. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s002

    (JPG)

    S3 Рис. Young

    tkv Клон эмбрионов зародышевой линии демонстрирует маркер активации транскрипции в PGCs.

    0–4 часа, фиксированные параформальдегидом (A) WT и (B/C) tkv m- эмбрионы окрашивали на маркер полюсных клеток Vasa (красный) и фосфоSer2 (активация транскрипции, зеленый).Символ Caret подчеркивает отсутствие сигнала pSer2, предполагая покой транскрипции, тогда как звездочка показывает, что потеря Vasa коррелирует с увеличением активации транскрипции. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s003

    (JPG)

    S4 Рис. Нарушение передачи сигналов BMP приводит к пятнистому накоплению h4meK4 в PGCs.

    Эмбрионы, фиксированные параформальдегидом в течение 0–4 часов (A) WT и (B) tkv 421 , были окрашены на маркер полюсных клеток Vasa (синий) и h4meK4 (красный).Символ Caret показывает отсутствие h4meK4, тогда как звездочка указывает на аберрантное присутствие сигнала h4meK4 в PGCs, маркера транскрипционно активного хроматина. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s004

    (JPG)

    S5 Рис. Компрометация уровней

    dpp приводит к эктопической локализации Vasa от заднего полюса эмбрионов.

    0–4 часа, фиксированные параформальдегидом (A) egfpi и (B) dpp hr92 эмбрионы окрашивали на маркер полюсных клеток Vasa (зеленый).Ядра были помечены с помощью Hoescht (синий). Звездочка показывает локализацию Vasa вдали от заднего полюса и инвазивную миграцию PGCs. Масштабная линейка представляет 10 мкм. (C) Профили участка, показывающие неправильную локализацию полярной плазмы (визуализированной с помощью Vasa) вдали от задней крышки (подробности количественной оценки см. в разделе «Материалы и методы»).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s005

    (JPG)

    S6 Рис. Потеря

    dpp не влияет на закрепление РНК зародышевой плазмы на заднем полюсе до отпочковывания PGC.

    smFISH выполняли с использованием зондов, специфичных для pgc (зеленый) и gcl (пурпурный) при фиксации параформальдегидом в течение 0–4 часов (A) ) точек на дюйм 33618 эмбрионов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s006

    (JPG)

    S7 Рис.

    dpp -эмбрионы с нарушениями обнаруживают dpERK в PGCs.

    0–4 часа, фиксированные параформальдегидом (A) WT и (B) dpp hr92 эмбрионы были окрашены на dpERK (красный).Ядра были помечены с помощью Hoescht (синий). Знак «Кэрет» указывает на отсутствие dpERK в PGC дикого типа, в то время как звездочкой отмечена эктопическая dpERK в dpp hr92 PGCs. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s007

    (JPG)

    S8 Рис. Одновременный компромисс

    oskar и dpp снижает адгезию между PGC.

    0–4 часа, фиксированные параформальдегидом (A) osk/+ и (B) dpp hr92 /+;osk/+ эмбрионы окрашивали на маркер клеток полюса Vasa.Масштабная линейка представляет 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010002.s008

    (JPG)

    Благодарности

    Авторы благодарят Эрика Вишауса и Труди Шупбах за многочисленные обсуждения, полезные предложения и реагенты в ходе этой работы. Лиз Гэвис, Стас Шварцман и Джаред Тотчер выражаем благодарность за постоянную поддержку. Крис Нг и Гордон Грей предоставили техническую помощь и корм для мух соответственно. Мы благодарим доктора Гэри Лаевского и Центр конфокальной визуализации, центр передового опыта Nikon, на факультете молекулярной биологии Принстонского университета за использование прибора.Г. Д. благодарит своих друзей из отдела биологии IISER Pune за щедрое гостеприимство.

    Каталожные номера

    1. 1. Экставур К.Г., Акам М. Механизмы спецификации зародышевых клеток многоклеточных животных: эпигенез и преформация. Разработка. Разработка; 2003. стр. 5869–5884. пмид:14597570
    2. 2. Бертоккини Ф., Чува де Соуза Лопес С.М. Развитие зародышевой линии у амниот: сдвиг парадигмы в спецификации первичных зародышевых клеток. Биоэссе.Джон Уайли и сыновья Inc .; 2016. С. 791–800. https://doi.org/10.1002/bies.201600025 pmid:27273724
    3. 3. Гюнесдоган У, Сурани М.А. Компетенция развития для судьбы первичных зародышевых клеток. Актуальные темы биологии развития. Академическая пресса Inc .; 2016. С. 471–496. https://doi.org/10.1016/bs.ctdb.2015.11.007 pmid:26969996
    4. 4. Агуэро Т., Кассмер С., Альберио Р., Джонсон А., Кинг М. Лу. Механизмы определения половых клеток позвоночных. Достижения экспериментальной медицины и биологии.ООО «Спрингер Нью-Йорк»; 2017. С. 383–440. https://doi.org/10.1007/978-3-319-46095-6_8 pmid:27975276
    5. 5. Ким ЮМ, Хан Джи. Раннее развитие половых клеток у кур. Int J Dev Biol. 2018; 62: 141–148. пмид:29616722
    6. 6. Хэнкок Г.В., Вамайта С.Е., Перец Л., Кларк А.Т. Спецификация первичных половых клеток млекопитающих. Девелопмент (Кембридж). ООО «Компания Биологов»; 2021. https://doi.org/10.1242/dev.189217 pmid:33722957
    7. 7. Сайто М., Ямадзи М.Спецификация зародышевых клеток у мышей: передача сигналов, регуляция транскрипции и эпигенетические последствия. Репродукция. Воспроизведение; 2010. стр. 931–942. пмид:20371640
    8. 8. Сайтоу М., Ямадзи М. Первичные зародышевые клетки у мышей. Колд Спринг Харб Перспект Биол. 2012;4. пмид:23125014
    9. 9. Накамура А., Сейду Г. Меньше значит больше: спецификация зародышевой линии путем репрессии транскрипции. Разработка. 2008. пмид:18997110
    10. 10. Сейду Г., Браун Р.Э.Путь к тотипотентности: уроки зародышевых клеток. Клетка. 2006. pmid:17129777
    11. 11. Leatherman JL, Levin L, Boero J, Jongens TA. Без зародышевых клеток действует для подавления транскрипции во время установления линии зародышевых клеток дрозофилы. Карр Биол. 2002. pmid:12361572
    12. 12. Колоннетта М.М., Лим Л.Р., Уилкинс Л., Каппес Г., Кастро Э.А., Райдер П.В. и соавт. Антагонизм между бесклеточным зародышевым рецептором и рецептором туловища регулирует транскрипционный покой, лежащий в основе различия зародышевой линии/сомы.Элиф. 2021; 10: 1–29. пмид:33459591
    13. 13. Дешпанде Г., Калхун Г., Шедл П. Механизмы перекрытия функционируют для установления транскрипционного покоя в эмбриональной зародышевой линии дрозофилы. Разработка. 2004. pmid:14960492
    14. 14. Мартиньо Р.Г., Кунвар П.С., Казанова Дж., Леманн Р. Некодирующая РНК необходима для подавления РНКполII-зависимой транскрипции в примордиальных зародышевых клетках. Карр Биол. 2004. pmid:14738740
    15. 15. Ханю-Накамура К., Сонобе-Нодзима Х., Танигава А., Ласко П., Накамура А.Белок Pgc дрозофилы ингибирует рекрутирование P-TEFb на хроматин в первичных зародышевых клетках. Природа. 2008. pmid:18200011
    16. 16. Кобаяши С., Ямада М., Асаока М., Китамура Т. Существенная роль нанозаднего морфогена в развитии зародышевой линии дрозофилы. Природа. 1996. pmid:8614464
    17. 17. Дешпанде Г., Калхун Г., Яновиц Д.Л., Шедл П.Д. Новые функции нано в подавлении митоза и транскрипции во время развития зародышевой линии дрозофилы.Клетка. 1999. pmid:10555143
    18. 18. Deshpande G, Calhoun G, Jinks TM, Polydorides AD, Schedl P. Nanos подавляет транскрипцию и модулирует фосфорилирование CTD в соме ранних эмбрионов дрозофилы. Мех Дев. 2005. pmid:15817222
    19. 19. Сейду Г., Данн М.А. Транскрипционно репрессированные зародышевые клетки лишены субпопуляции фосфорилированной РНК-полимеразы II у ранних эмбрионов Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster. Разработка. 1997.
    20. 20.Seki Y, Yamaji M, Yabuta Y, Sano M, Shigeta M, Matsui Y и др. Клеточная динамика, связанная с эпигенетическим перепрограммированием всего генома в мигрирующих первичных зародышевых клетках у мышей. Разработка. 2007; 134: 2627–2638. пмид:17567665
    21. 21. Шанер К.Э., Дешпанде Г., Шедл П.Д., Келли В.Г. Консервативная архитектура хроматина маркирует и поддерживает ограниченную линию зародышевых клеток у червей и мух. Ячейка Дев. 2003. pmid:14602075
    22. 22. Секи Ю, Хаяши К, Ито К, Мизугаки М, Сайто М, Мацуи Ю.Обширное и упорядоченное перепрограммирование полногеномных модификаций хроматина, связанных со спецификацией и ранним развитием зародышевых клеток у мышей. Дев биол. 2005; 278: 440–458. пмид:15680362
    23. 23. Хайкова П., Анселин К., Вальдманн Т., Лакост Н., Ланге У.К., Чезари Ф. и др. Динамика хроматина во время эпигенетического перепрограммирования в зародышевой линии мышей. Природа. 2008; 452: 877–881. пмид:18354397
    24. 24. Фукуяма М., Ругви А.Е., Ротман Дж.Х. C. elegans DAF-18/PTEN опосредует зависимую от питательных веществ остановку клеточного цикла и роста в зародышевой линии.Карр Биол. 2006; 16: 773–779. пмид:16631584
    25. 25. Асаока-Тагучи М., Ямада М., Накамура А., Ханью К., Кобаяши С. Материнский Пумилио действует вместе с Нано в развитии зародышевой линии у эмбрионов дрозофилы. Nat Cell Biol. 1999; 1: 431–437. пмид:10559987
    26. 26. Кадырова Л.Я., Хабара Ю., Ли Т.Х., Уортон Р.П. Трансляционный контроль материнской мРНК Cyclin B с помощью Nanos в зародышевой линии дрозофилы. Разработка. 2007; 134: 1519–1527. пмид:17360772
    27. 27. Охината Ю, Охта Х, Шигета М, Яманака К, Вакаяма Т, Сайтоу М.Сигнальный принцип для спецификации линии зародышевых клеток у мышей. Клетка. 2009; 137: 571–584. пмид:19410550
    28. 28. Qi X, Li TG, Hao J, Hu J, Wang J, Simmons H, et al. BMP4 поддерживает самообновление эмбриональных стволовых клеток путем ингибирования путей митоген-активируемых протеинкиназ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101: 6027–6032. пмид:15075392
    29. 29. Лоусон К.А., Данн Н.Р., Роелен Б.А.Дж., Зейнстра Л.М., Дэвис А.М., Райт К.В.Э. и др. Bmp4 необходим для образования первичных зародышевых клеток у эмбриона мыши.Гены Дев. 1999; 13: 424–436. пмид:10049358
    30. 30. Ying Y, Liu XM, Marble A, Lawson KA, Zhao GQ. Необходимость Bmp8b для образования первичных зародышевых клеток у мышей. Мол Эндокринол. 2000; 14: 1053–1063. пмид:10894154
    31. 31. Ин И, Чжао GQ. Сотрудничество BMP2, происходящего из энтодермы, и BMP4, происходящего из внеэмбриональной эктодермы, в образовании первичных зародышевых клеток у мышей. Дев биол. 2001; 232: 484–492. пмид:11401407
    32. 32. Окамура Д., Хаяси К., Мацуи Ю.Эпибласты мыши изменяют чувствительность к сигналу BMP4, необходимому для образования PGC, посредством функций внеэмбриональной эктодермы. Мол Репрод Дев. 2005; 70: 20–29. пмид:15515057
    33. 33. Чанг Х, Мацук ММ. Smad5 необходим для развития первичных зародышевых клеток мыши. Мех Дев. 2001; 104: 61–67. пмид:11404080
    34. 34. Hayashi K, Kobayashi T, Umino T, Goitsuka R, Matsui Y, Kitamura D. Передача сигналов SMAD1 имеет решающее значение для начальной фиксации линии зародышевых клеток из эпибласта мыши.Мех Дев. 2002; 118: 99–109. пмид:12351174
    35. 35. Мелло К.С., Шуберт С., Дрейпер Б., Чжан В., Лобель Р., Присс Дж. Р. Белок PIE-1 и спецификация зародышевой линии у эмбрионов C. elegans. Природа. 1996; 382: 710–712. пмид:8751440
    36. 36. Фаррелл Дж. А., О’Фаррелл PH. От яйца к гаструле: как реконструируется клеточный цикл во время перехода дрозофилы в среднюю бластулу. Анну Рев Жене. 2014. pmid:25195504
    37. 37. Рафф Дж.В., Гловер Д.М. Центросомы, а не ядра, инициируют образование полюсных клеток у эмбрионов дрозофилы.Клетка. 1989.
    38. 38. Лерит Д.А., Гэвис Э.Р. Транспорт зародышевой плазмы по астральным микротрубочкам направляет развитие зародышевых клеток у дрозофилы. Карр Биол. 2011. пмид:21376599
    39. 39. Робертсон С.Е., Докендорф Т.С., Лезерман Дж.Л., Фолкнер Д.Л., Йонгенс Т.А. бесклеточный зародышевый Требуется только во время установления линии зародышевых клеток дрозофилы и обладает активностью, которая зависит и не зависит от его локализации в ядерной оболочке. Дев биол. 1999. pmid:10545238
    40. 40.Лерит Д.А., Шебелут К.В., Лоулор К.Дж., Русан Н.М., Гэвис Э.Р., Шедл П. и соавт. Отсутствие зародышевых клеток способствует сегрегации центросом, чтобы вызвать образование зародышевых клеток. Cell Rep. 2017; 18: 831–839. пмид:28122234
    41. 41. Леманн Р. Биогенез зародышевой плазмы — Оскар-центрическая перспектива. Актуальные темы биологии развития. Академическая пресса Inc .; 2016. С. 679–707. https://doi.org/10.1016/bs.ctdb.2015.11.024 pmid:26970648
    42. 42. Lehmann R, Nüsslein-Volhard C. Сегментация брюшка, формирование полярных клеток и эмбриональная полярность требуют локализованной активности oskar, материнского гена у дрозофилы.Клетка. 1986; 47: 141–152. пмид:30
    43. 43. Ильмензее К., Маховальд А.П. Трансплантация задней полярной плазмы у дрозофилы. Индукция половых клеток на переднем полюсе яйца. Proc Natl Acad Sci USA. 1974. pmid:4208545
    44. 44. Эфрусси А., Леманн Р. Индукция образования зародышевых клеток с помощью Оскара. Природа. 1992. пмид:1641021
    45. 45. Смит Дж. Л., Уилсон Дж. Э., Макдональд П. М. Сверхэкспрессия oskar направляет эктопическую активацию nanos и образование предполагаемых полярных клеток у эмбрионов Drosophila.Клетка. 1992; 70: 849–859. пмид:1516136
    46. 46. Ван Дорен М., Уильямсон А.Л., Леманн Р. Регуляция экспрессии зиготических генов в примордиальных зародышевых клетках дрозофилы. Карр Биол. 1998. пмид:9501989
    47. 47. Дешпанде Г., Суонхарт Л., Чианг П., Шедл П. Передача сигналов ежа при миграции зародышевых клеток. Клетка. 2001; 106: 759–769. пмид:11572781
    48. 48. Дешпанде Г., Шедл П. Редуктаза HMGCoA усиливает передачу сигналов ежа у Drosophila melanogaster. Ячейка Дев.2005; 9: 629–638. пмид:16256738
    49. 49. Kim JH, Hanlon CD, Vohra S, Devreotes PN, Andrew DJ. Передача сигналов Hedgehog и Tre1 регулируют динамику актина посредством PI(4,5)P2 для прямой миграции эмбриональных зародышевых клеток Drosophila. Представитель ячейки 2021; 34. пмид:33657369
    50. 50. Дешпанде Г., Уиллис Э., Чаттерджи С., Фернандес Р., Диас К., Шедл П. Передача сигналов BMP и поддержание идентичности первичных зародышевых клеток у эмбрионов дрозофилы. ПЛОС Один. 2014;9. пмид: 24551179
    51. 51.Renault AD, Ricardo S, Kunwar PS, Santos A, Starz-Gaiano M, Stein JA и др. Hedgehog не направляет мигрирующие зародышевые клетки дрозофилы. Дев биол. 2009; 328: 355–362. пмид:1
    52. 45
    53. 52. Дорфман Р., Шайло Б.З. Двухфазная активация пути BMP паттерна эмбриональной дорсальной области Drosophila. Разработка. 2001; 128: 965–972. пмид:11222150
    54. 53. Уортон К., Рэй Р.П., Финдли С.Д., Дункан Х.Е., Гелбарт В.М. Молекулярные повреждения, связанные с аллелями декапентаплегии, идентифицируют остатки, необходимые для передачи сигналов TGF-β/BMP клетками у Drosophila melanogaster.Генетика. 1996; 142: 493–505. пмид:8852848
    55. 54. Рэй Р.П., Арора К., Нуссляйн-Фольхард С., Гелбарт В.М. Контроль судьбы клеток вдоль дорсально-вентральной оси эмбриона дрозофилы. Разработка. 1991; 113: 35–54. пмид:1765005
    56. 55. Браммель Т.Дж., Твомбли В., Маркес Дж., Врана Дж.Л., Ньюфельд С.Дж., Аттисано Л. и др. Характеристика и взаимосвязь рецепторов dpp, кодируемых генами саксофона и толстых жилок у дрозофилы. Клетка. 1994; 78: 251–261. пмид:8044839
    57. 56.Шимми О., Умулис Д., Отмер Х., О’Коннор М.Б. Облегченный транспорт гетеродимера Dpp/Scw с помощью Sog/Tsg приводит к надежному формированию паттерна эмбриона бластодермы дрозофилы. Клетка. 2005; 120: 873–886. пмид:15797386
    58. 57. Су ТТ, Кэмпбелл С.Д., О’Фаррелл Р.Х. Программа клеточного цикла в половых клетках эмбриона дрозофилы. Дев биол. 1998; 196: 160–170. пмид:9576829
    59. 58. Hendzel MJ, Wei Y, Mancini MA, Van Hooser A, Ranalli T, Brinkley BR, et al. Митозоспецифическое фосфорилирование гистона h4 инициируется преимущественно внутри перицентромерного гетерохроматина во время G2 и распространяется упорядоченным образом, совпадающим с митотической конденсацией хромосом.Хромосома. 1997. pmid:43
    60. 59. Хуан Г., Траганос Ф., Дарзинкевич З. Фосфорилирование гистона h4 в моноцитах человека и во время дифференцировки клеток HL-60. Разрешение ячейки опыта. 1999; 246: 212–220. пмид:9882530
    61. 60. Блэквелл ТК. Зародышевые клетки: поиск программ массовых репрессий. Текущая биология. 2004. pmid:15043831
    62. 61. Пироволакис Г., Хартманн Б., Мюллер Б., Баслер К., Аффольтер М. Простой молекулярный комплекс опосредует широко распространенную BMP-индуцированную репрессию во время развития дрозофилы.Ячейка Дев. 2004;7: 229–240. пмид:15296719
    63. 62. Сент-Джонстон Р.Д., Хоффманн Ф.М., Блэкман Р.К., Сигал Д., Гримейла Р., Паджетт Р.В. и др. Молекулярная организация гена декапентаплегии у Drosophila melanogaster. Гены Дев. 1990;4: 1114–1127. пмид:2120113
    64. 63. Пентон А., Чен Ю., Стелинг-Хэмптон К., Врана Дж. Л., Аттисано Л., Сидонья Дж. и др. Идентификация двух рецепторов костного морфогенетического белка типа I у дрозофилы и доказательство того, что Brk25D является декапентаплегическим рецептором.Клетка. 1994; 78: 239–250. пмид:8044838
    65. 64. Yan S, Acharya S, Gröning S, Großhans J. Белок Slam определяет субклеточную локализацию и трансляцию собственной мРНК. PLoS биол. 2017;15. пмид:227
    66. 65. Pae J, Cinalli RM, Marzio A, Pagano M, Lehmann R. GCL и CUL3 контролируют переключение между клеточными линиями, опосредуя локализованную деградацию RTK. Ячейка Дев. 2017. pmid:28743001
    67. 66. Джонсон Х.Е., Гоял Ю., Паннуччи Н.Л., Шюпбах Т., Шварцман С.Ю., Тотчер Дж.Е.Пространственно-временные ограничения передачи сигналов Erk в процессе развития. Ячейка Дев. 2017; 40: 185–192. пмид:28118601
    68. 67. Джонсон Х.Э., Тотчер Дж.Э. Динамика передачи сигналов контролирует судьбу клеток в раннем эмбрионе дрозофилы. Ячейка Дев. 2019;48: 361–370.e3. пмид:30753836
    69. 68. Goyal Y, Jindal GA, Pelliccia JL, Yamaya K, Yeung E, Futran AS, et al. Различные эффекты внутренне активных вариантов MEK на передачу сигналов Ras в процессе развития. Нат Жене. 2017. pmid:28166211
    70. 69.Geigy R. Erzeugung Reimaginaler Defekte durch ultraviolette Eibestrahlung bei Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Arch Entwickl Mech Org. 1931; 125: 406–447. пмид:28354796
    71. 70. Поулсон ДФ. Полюсные клетки двукрылых, их судьба и значение. Proc Natl Acad Sci U S A. 1947; 33: 182–184. пмид:16588739
    72. 71. HATHAWAY DS, SELMAN GG. Некоторые аспекты клеточного происхождения и морфогенеза изучены у эмбрионов Drosophila melanogaster с помощью ультрафиолетового микролуча.J Embryol Exp Morphol. 1961; 9: 310–325. пмид:13712240
    73. 72. Окада М., Клейнман И.А., Шнейдерман Х.А. Восстановление фертильности стерилизованных яиц дрозофилы путем трансплантации полярной цитоплазмы. Дев биол. 1974; 37: 43–54. пмид:4207296
    74. 73. Lehmann R, Nusslein-Volhard C. Материнский ген nanos играет центральную роль в формировании заднего паттерна эмбриона дрозофилы. Разработка. 1991.
    75. 74. Кимура Т., Кага Ю., Охта Х., Одамото М., Секита Ю., Ли К. и др.Индукция первичных зародышевых клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши путем ингибирования сигнала ERK. Стволовые клетки. 2014; 32: 2668–2678. пмид: 24989326
    76. 75. Rusch J, Levine M. Регуляция дорсального морфогена сигнальными путями Toll и torso: рецепторная тирозинкиназа избирательно маскирует репрессию транскрипции. Гены Дев. 1994;8: 1247–1257. пмид:78
    77. 76. Ким Ю., Андреу М.Дж., Лим Б., Чанг К., Тераяма М., Хименес Г. и др. Регуляция генов за счет конкуренции субстратов МАРК.Ячейка Дев. 2011; 20: 880–887. пмид:21664584
    78. 77. Ян С.Дж., Зартман Дж.Дж., Чжан М., Скотт А., Шварцман С.Ю., Ли В.С. Бистабильность координирует активацию путей EGFR и DPP при дифференцировке жилок дрозофилы. Мол Сист Биол. 2009;5. пмид:19536201
    79. 78. Deignan L, Pinheiro MT, Sutcliffe C, Saunders A, Wilcockson SG, Zeef LAH, et al. Регуляция сигнально-чувствительной транскрипционной сети BMP в эмбрионе дрозофилы. Генетика PLoS. 2016;12. пмид: 27379389
    80. 79.Чанг Т., Шай Д., Хартенштейн В. Антагонистические отношения между передачей сигналов Dpp и EGFR в формировании паттерна головы дрозофилы. Дев биол. 2003; 263: 103–113. пмид:14568549
    81. 80. Блондель Л., Джонс Т.Э., Экставур К.Г. Бактериальный вклад в генезис нового детерминанта зародышевой линии Oskar. Элиф. 2020;9. пмид:320

    Устойчивое развитие | Бесплатный полнотекстовый | Предсказывают ли морфологические признаки экологические гильдии рыбной фауны Меконга?

    1.Введение

    Бассейн реки Меконг (БРМ) представляет собой биологически разнообразную и высокопродуктивную экосистему, занимающую третье место в мире по разнообразию рыб после бассейнов рек Амазонки и Конго, где обитает более 850 видов пресноводных рыб [1]. Эти виды классически сгруппированы в три гильдии в соответствии с их миграционными привычками, называемые «черными», «белыми» и «серыми» гильдиями [2,3]. Белые рыбы являются дальними мигрантами, мигрирующими вдоль основного течения Меконга или между основным течением Меконга и озером Тонлесап в Камбодже, крупнейшей системой пульсирующих озер в Юго-Восточной Азии [4].Серые рыбы мигрируют на короткие расстояния, часто мигрируя между озером Тонлесап или рекой Меконг и их поймами или притоками. Черные рыбы не мигрируют и постоянно остаются в одном и том же водоеме, например, в озерах, прудах, реках или рисовых полях. Аналогичная классификация применялась к амазонской ихтиофауне, в которой Вайнмиллер (1989) различал оседлые, короткомигрирующие и долгомигрирующие виды. Каждая из этих трех категорий рыб имеет разные стратегии жизненного цикла, поддерживаемые различными репродуктивными и морфологическими признаками [5,6].Однако эквивалентной классификации для ихтиофауны Меконга не существует, а выраженные таксономические, функциональные и экологические различия между неотропической и восточной фаунами делают амазонскую миграционную классификацию Вайнмиллера (1989) неприменимой к контексту ихтиофауны Меконга [7]. ]. В настоящее время в реке Меконг белый, черный или серый статус видов рыб известен только для 24% ихтиофауны (165 видов), и определение того, подтверждается ли такая классификация морфологическими характеристиками, может помочь распространить эту классификацию на 76% видов, для которых миграционный статус остается неизвестным [2,3,8].Такие выводы представляют особый интерес, поскольку в настоящее время река Меконг сталкивается с серьезными антропогенными угрозами, такими как чрезмерный вылов и фрагментация плотинами, которые могут по-разному влиять на виды рыб в зависимости от их миграционного статуса [1]. Предыдущие исследования, основанные на других речных системах, выявили значительные связи. между морфологией рыб и их миграционным статусом, историей жизни и функциональными группами [9]. В исследованиях, проведенных на Жемчужной реке в Южном Китае, авторы описали изменения морфологических признаков рыб в зависимости от градиента окружающей среды, в то время как о замечательной связи между морфометрическими переменными и миграционным статусом видов рыб сообщалось в бассейне реки Парана в Амазонии [10,11]. .С другой стороны, в исследованиях скандинавских озер миграционное поведение пресноводных рыб использовалось в качестве предиктора морфологических признаков рыб [12]. Следовательно, наше исследование было направлено на (1) изучение связей между морфологическими признаками и статусом миграции для видов рыб Меконга, уже классифицированных как черные, белые и серые рыбы, и (2) проверить, может ли морфология рыб предсказать гильдии рыб Меконга. Идентификация черных, белых и серых рыб по их морфологии, в то время как их миграционный статус и история жизни неизвестны, может оказаться важным шагом для создания экологических знаний о миграции рыб Меконга и истории жизни видов.

    3. Результаты

    Первые две оси PCA объяснили 51,3% общей дисперсии и показали заметное совпадение между тремя гильдиями рыб (черная, белая и серая) (рис. 2а). В целом, процедура повторной выборки, использованная для разделения общей изменчивости с помощью PCA между разными группами, не повлияла на разложение дисперсии и подтвердила это морфологическое совпадение между тремя гильдиями, выявив сильный и последовательный компонент внутригильдийной изменчивости (среднее = 0,894, SD = 0,017). ). Что касается признаков, которые значительно (рис. 2b), то серые рыбы оказались промежуточной группой, охватывающей широкий спектр морфологий (рис. 2b).С морфологической точки зрения группа белых рыб отличалась высоким удушением хвостового стебля (CFdCPd) и низким удлинением тела (BlBd) по сравнению с группой черных рыб, что указывает на то, что виды белых рыб обладают высокой плавательной способностью и веретенообразным и /или компрессионная форма тела (рис. 2б). Напротив, группа черных рыб характеризовалась низким удушением хвостового стебля (CFdCPd), высоким вертикальным положением грудных плавников (PFiBd) и удлинением тела (BlBd), что указывает на малоподвижное поведение и удлиненную или угловатую форму тела (рис. 2b).Морфология группы серых рыб была похожа на группу белых рыб, несмотря на более низкую плавательную способность (т. е. более низкое значение CFdCPd) и большее удлинение тела (BlBd) (рис. 2b). Несмотря на сильное морфологическое совпадение между тремя гильдиями, Прогностическая эффективность алгоритма случайного леса показала общую точность 50,4% (61/121 вид) с правильными назначениями 52,6% для гильдий черных и серых рыб и 46,7% для гильдий белых рыб. Дросселирование хвостового стебля (CFdCPd) и вертикальное положение грудного плавника (PFiBd) были наиболее важными предикторами гильдий рыб, за которыми следовали удлинение тела (BlBd) и положение рта (MoBd) (рис. 2c).

    4. Обсуждение

    Морфологически гильдия черных рыб хорошо отличалась от гильдии белых рыб, хотя между группами существуют некоторые совпадения. Такие различия подчеркивают разные способности к передвижению между группами рыб. Белые рыбы характеризовались высокой плавательной выносливостью, на что указывает сильное удушение их хвостового стебля [27,28]. Эти белые рыбы также продемонстрировали важную маневренность при высоких скоростях плавания из-за вентрального положения их грудных плавников [29].Такие морфологические особенности свидетельствуют о высокоподвижных видах, приспособленных к длительным путешествиям в речных условиях [17]. Таким образом, он подходит для мигрирующих на большие расстояния видов, которые перемещаются вдоль основного течения Меконга и в крупных притоках, таких как Cyclocheilichthys enoplos, Gymnostomus siamensis и Pangasius hypophthalmus. Напротив, группа черных рыб характеризовалась более высокой, хотя и более энергозатратной, эффективностью движения хвостовым плавником из-за низкого дросселирования хвостового стебля [27, 28].Эта черта связана с гидродинамическими формами тела (удлиненными телами) и указывает на то, что черные виды способны достигать быстрых ускорений для преодоления препятствий (таких как пороги и водопады), избегать нападения хищников и захватывать подвижную добычу [27,30]. Эти виды также используют грудные плавники для передвижения и способны совершать точные движения в сложных условиях (например, в затопленной растительности) благодаря боковому положению грудных плавников [17,27,29]. Поэтому эти рыбы приспособлены к перемещению на короткие расстояния в сложных условиях, таких как мелководье, затопленные леса или прибрежные зоны.Такие места обитания подходят для черных видов, таких как Clarias macrocephalus, Trichogaster sp., Channa striata или Macrognathus siamensis. Наконец, хотя признаки, связанные с кормлением, играют второстепенную роль, белые рыбы, как правило, имеют большие глаза и меньший рот, чем у черных рыб, что указывает на то, что зрение играет более важную роль для мигрирующих рыб, которые охотятся на более мелкие объекты пищи, чем они. для черных рыб. Эта тенденция отражается в более высокой доле питающихся пелагическим планктоном гильдий белых рыб, тогда как черные рыбы чаще бывают бентосными (т.g., Macrognathus sp.) или ихтиофагов (например, Channa sp.), у которых зрение менее важно для обнаружения добычи на темном дне рек.

    Такие морфологические различия между гильдиями позволили разработать случайную модель леса, предсказывающую принадлежность к гильдии на основе морфологии, с такими признаками, связанными с плаванием рыб, как эффективность хвостового движения (CFdCPd), вертикальное положение грудных плавников (PFiBd) и удлинение тела. (BlBd), внося большой вклад. Тем не менее, качество предсказания членства в гильдии, хотя и справедливое, с 50% правильным предсказанием для трех гильдий, остается надежным.

    Ограниченная прогностическая эффективность модели случайного леса может быть прежде всего связана с большим разнообразием видов рыб в Меконге (> 850 видов) в сочетании с заметным морфологическим сходством ихтиофауны Меконга по сравнению с неотропическими мегаразнообразными реками, такие как Амазонка, Парагвай-Парана или реки Ориноко [7]. Это морфологическое сходство хотя бы частично поддерживалось доминированием одного семейства рыб (Cyprinidae), включающего более 200 видов со схожими формами тела, но разным репродуктивным и миграционным статусом гильдии [31].Во-вторых, определение гильдии серых рыб было недостаточно четким, так как термин «миграция на короткие расстояния» является расплывчатым, что требует дополнительной детализации определения ареала миграции (например, количественного определения расстояния миграции). В тропических регионах многие виды рыб совершают сезонные миграции, чтобы достичь своих основных мест обитания (нагула, нереста и убежища в сухой сезон) [5]. Таким образом, диапазон миграции для гильдий серых и белых рыб (т. е. полумигрирующих и дальних мигрантов) должен быть четко определен, чтобы обеспечить соответствующую классификацию гильдий [32,33].В-третьих, сложность системы Меконга (т. е. связь между Меконгом и озером Тонлесап или с другими важными притоками) затрудняет разграничение продольных (вверх-вниз по течению) миграций в основном течении (характеризующих белых рыб) и боковые миграции между озерами и притоками, приписываемые серым рыбам. Тем не менее, было замечено, что белые рыбы также совершают эти боковые миграции, а не только серые рыбы, как считалось ранее [34,35], что может объяснить некоторую путаницу между гильдиями белых и серых рыб.Чтобы справиться с этими неопределенностями, дополнительные биологические признаки, такие как способность к расселению, информация о кормлении и нересте, связанная с факторами окружающей среды, будут дополнять морфологические признаки и повышать точность прогнозов гильдий рыб Меконга [33]. Это особенно верно для видовых семейств рыб со сходной морфологией среди видов (например, для Cyprinidae, Siluridae, Pangasiidae, Bagridae, Osphronemidae, Clupeidae) или даже со сходной морфологией между семействами (например.г., карповые против осфронемид; Siluridae против Bagridae) [8,34]. Кроме того, качество прогноза гильдии также может быть улучшено за счет увеличения числа учитываемых видов. В данном исследовании мы использовали 121 вид, что составляет менее 20% ихтиофауны, в то время как миграционный статус почти всей остальной ихтиофауны Меконга до сих пор неизвестен [3]. Среди рассмотренных видов многие принадлежали к семейству карповых (56 видов), что потенциально ограничивало прогностическую точность модели.Учитывая эти потенциальные отклонения в классификации гильдий черно-серо-белых, в этом исследовании мы продемонстрировали морфологические различия между гильдиями, которые согласуются с миграционным статусом вида. Поэтому мы призываем к проведению дополнительных исследований, которые могут расширить базовые экологические знания об ихтиофауне Меконга, и особенно о значительной части фауны, экология которой остается неизвестной. Эти текущие результаты дают представление о прогнозировании неизвестных гильдий рыб на основе доступных внешних морфологических признаков, которые могут обогатить доступный набор данных о статусе миграции рыб Меконга для оставшихся видов после того, как будут доступны данные о морфологии рыб.Этот метод может быть очень полезен для понимания такой разнообразной биологической системы, как река Меконг. Что еще более важно, эта информация о миграции необходима для сохранения биоразнообразия и устойчивого развития речных бассейнов (например, план развития гидроэнергетики). Точная информация о характере миграции рыб поможет свести к минимуму или смягчить воздействие, вызванное деятельностью человека, например, определение границ плотины, чтобы избежать разрушения критических мест обитания мигрирующих рыб (например,г., места нереста, нагула и нагула). Кроме того, группа белых рыб часто уязвима из-за фрагментации их критически важных местообитаний. Сохранение миграционных путей помогло бы сохранить биомассу белой рыбы, чтобы компенсировать потребление, так как на долю белой рыбы приходилось 36% общего улова рыбы, полученной для потребления человеком [13]. Эти текущие исследования позволили бы разработать более подробную гильдию. типология, в соответствии с ареалами миграции рыб и другой связанной биоэкологической информацией о видах (например,g., способность к расселению, стратегии питания и жизненного цикла) [33]. Это станет шагом вперед для дальнейших биоэкологических исследований гиперразнообразной системы Меконга и может предоставить возможность не только обобщить такие классификации на другие аналогичные системы азиатских рек, но и распространить их на другие крупные и мегаразнообразные реки по всему миру. Таким образом, необходимо расширить базу данных морфологических признаков ихтиофауны Меконга, чтобы построить конкретное многомерное функциональное пространство для бассейна реки Меконг.Это будет особенно важно для остальных видов. Таким образом, следует приложить больше усилий для отбора проб большего количества видов рыб с примерами особей из разных классов размера, чтобы улучшить качество набора функциональных данных, особенно в отношении экономически важных и находящихся под угрозой исчезновения видов. В дополнение к морфологии рыбы, биологические характеристики (такие как стратегии размножения и кормления) следует рассматривать как ключевую информацию, которая должна быть интегрирована для создания всеобъемлющего функционального набора данных для бассейна реки Меконг, который мог бы повысить точность прогнозирования гильдий для ихтиофауны Меконга. .Наконец, этот всеобъемлющий функциональный набор данных может быть использован для оценки миграционного статуса или прогнозирования экологической гильдии меконгских рыб, а также для оценки долгосрочных изменений в стабильности экосистемы Меконга и функциональной реакции на множественные воздействия климатических факторов и человека.
  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.