Ген AP2 из Arabidopsis был использован для скрининга двух библиотек кДНК кукурузы с низкой строгостью, одна получена из незрелых початков, а другая из вегетативных. меристемы.Один и тот же класс кДНК был выделен из каждой библиотеки. Самый длинный клон этого класса состоял из 1967 нуклеотидов и содержала ORF из 433 аминокислот (фиг.) с несколькими доменами, демонстрирующими поразительное аминокислотное сходство с геном AP2 Arabidopsis (Jofuku et al. 1994). Было обнаружено два тандемно повторяющихся мотива из 68 аминокислот, которые на 86% идентичны по аминокислотам с доменом AP2 белка Arabidopsis AP2. Семейство генов AP2 можно разделить на две группы, обозначенные как EREBP-подобные или AP2-подобные, в зависимости от того, обладают ли они один или два повтора AP2 соответственно (Okamuro et al.1997). Белок IDS1 относится к последнему классу, который включает белки AP2, AINTEGUMENTA, GLOSSY15 и RAP2.7 (рис.) (Jofuku et al. 1994; Klucher et al. 1996; Moose and Sisco 1997; Okamuro et al. 1997). Белки табака ERE-BP, которые имеют только один из этих повторов, связывают ДНК (Ohme-Takagi and Shinshi 1995). Таким образом, по аналогии вполне вероятно, что IDS1 действует как фактор транскрипции. В подтверждение этого краткий отрезок основных аминокислоты, которые могут функционировать как домен ядерной локализации, присутствуют в белке IDS между 100 и 110 аминокислотами. (Рис.). Белок AP2 из Arabidopsis содержит богатый серином кислотный домен на аминоконце, который может функционировать как домен активации (Jofuku et al. 1994). Хотя подобная область находится на аминоконце белка IDS1 в положениях 9–45, область намного меньше и имеет меньше кислотных и сериновых остатков по сравнению с AP2. Вне домена AP2 существует очень небольшое сходство последовательностей между AP2 и IDS1. Учитывая это открытие, удивительно, что положения шести интронов в домене AP2 сохраняются. между ids1 и AP2 (рис.). Аналогичный результат был получен для гена gl15 кукурузы (Moose and Sisco 1997).

Нуклеотид и выведенная аминокислотная последовательность IDS1. Аминокислотные числа показаны слева от ; нуклеотиды пронумерованы справа . Подчеркнутые аминокислотные последовательности представляют два домена AP2 (Jofuku et al.1994). Серины и кислые аминокислоты на амино-конце обозначены коротким подчеркиванием. Аминокислотные последовательности выделены жирным шрифтом представляют собой основной регион с предполагаемой активностью ядерной локализации. Жирные нуклеотидные последовательности соответствуют ZAP2-1. праймер, используемый для скрининга ПЦР. (▿) шесть положений интрона, сохраненные между IDS, AP2, и GL15; (▾) другой интрон.

Сравнение между доменами AP2 AP2 -подобных генов. Выведенные аминокислотные последовательности доменов AP2 IDS1 (номер доступа в GenBank AF048900), RAP2.7 (AF003100), GL15 (U41466) и ANT (U40256) сравниваются с AP2 (ATU12546). Область между двумя повторами AP2, то есть линкерная область, начинается с аминокислоты 78 и заканчивается на 102. Для облегчения совмещения были введены зазоры, представленные точками. Аминокислоты, общие для всех пяти белки выделены жирным шрифтом и на согласованной последовательности внизу .

ids1 был картирован на длинном плече первой хромосомы в положении 192 с использованием рекомбинантных инбредных линий (Burr et al. 1988), зондированных неповторяющимся фрагментом ДНК с 3′-конца ids1. Никакие известные морфологические мутанты не были картированы в этой позиции.

Выделение рецессивных

Чтобы выяснить функцию ids1, , мы использовали обратную генетическую стратегию для генерации аллелей с потерей функции. ПЦР использовали на большой популяции растений, несущих Mutator ( Mu ) транспозоны для поиска вставок в ID1 (Bensen et al.1995; Мили и Бриггс 1995). Праймеры, фланкирующие домен AP2 ID1 в комбинации с праймерами Mu , дали два независимых события вставки на этом скрининге. Секвенирование продуктов ПЦР позволило локализовать вставки точнее. Как показано на рисунке, вставка Mu в ids1-mum1 была локализована в пятом консервативном интроне домена AP2 , тогда как вставка ids1-mum2 была локализована в первом консервативном интроне на расстоянии 6 п. н. акцепторный сайт сплайсинга.Поскольку элементов Mu и генерируют дупликацию 9 bp при вставке (Bennetzen et al. 1993), акцепторный сайт сплайсинга также находится на 5′-конце Mu.

Локализация элементов Mu в ids1 – mum1 и ids1 – mum2. ids1 последовательности интрона и экзона показаны нормальным и жирным шрифтом соответственно.Номера интронов и экзонов показаны выше. последовательности ДНК. Подчеркнутые последовательности представляют характерную дупликацию 9 пар оснований, связанную со вставками Mu .

Линии, несущие аллели ids1 – mum1 и ids1 – mum2 , демонстрировали рецессивный цветочный фенотип, который был более серьезным в линиях ids1 – mum2 . Чтобы убедиться, что вставки в ids1 ответственны за цветочный фенотип, мы проанализировали ДНК из 104 растений F2, используя ген ids1 в качестве зонда на гель-блотах ДНК. Косегрегация новых RFLP с цветочным фенотипом наблюдалась для 29 хромосом. содержащий аллель ids1 – mum1 и 91 хромосому, содержащий ids1 – mum2 (данные не показаны). Не было обнаружено рекомбинантов между цветочным фенотипом и ids1 – mum -специфическими полиморфизмами ни для одного из аллелей.

Мы проанализировали фенотипы ids1 – mum растений после обратного скрещивания с A632 и самоопыления. Наиболее устойчивым фенотипом у мутантов ids1 – mum был дефект в колоске. Зрелые колоски кисточки дикого типа содержат два цветочка, каждый из которых состоит из трех тычинок. и две лодикулы, заключенные в прицветники палеи и леммы (рис. B). Палеа отличается от леммы в силу того, что его положение и тот факт, что он двухкилочный с двойной средней жилкой (Clifford and Watson 1977). Колоски кисточек ids1 – mum2 больше, чем у кистей дикого типа (Рис. A), из-за того, что присутствуют лишние соцветия (Рис. C). Номер Количество цветков колеблется от минимум 3 на ids1 – mum1 растений до целых 10 на ids1 – mum2 растений. В дополнение к этим цветочкам, между ними обычно можно увидеть тонкую рахиллу, содержащую несколько более мелких цветков. два самых верхних цветочка (рис. F). Эти более мелкие соцветия, как правило, постепенно уменьшаются, так что оставшиеся кончик рахиллы едва заметен.Более крупные дополнительные соцветия показывают нормальный образец половой дифференциации и имеют правильное количество тычинок и лодикул, окруженных палеей и леммой (рис. C).

Фенотипы у ids1 – мамы мужских и женских колосков. ( A ) Колосок с кисточкой нормальный A632 ( слева, ) и ids1 – mum2 колос с кисточкой ( справа, ).( B ) Рассеченный нормальный колоск кисточки A632 показывает боковые органы верхних и нижних соцветий. ( C ) Расщепленный ids1 – mum2 колоск с кисточкой, показывающий четыре цветочка вместо двух. У каждого цветочка по три тычинки, окруженные палеой и леммой, как в A632. ( D ) Колосок нормальный A632 ( слева, ) и ids – mum1 колосок ушной раковины ( справа ). Стрелки указывают на шелк. ( E ) Срединные продольные срезы неоплодотворенного 25-дневного ребенка ids1 – mum2 ушной колоск ( слева, ) и ушной колос A632 ( справа, ).Черные стрелки указывают на цветочки. Колоски А632 имеют одиночный цветочек с увеличенным нуцеллусом; ids1 – mum2 колоски ушей имеют по крайней мере три цветочка со значительно сниженным развитием боковых органов. ( F ) ids1 – mum2 колоск на ухе с удлиненной рахиллой, содержащей два цветочка. Одиночная стрелка указывает на кончик рахиллы. (st) тычинки; (il) внутренняя лемма; (па) палеа; (ol) внешняя лемма; (ig) внутренняя чешуйка; (og) наружная чешуйка; (уф) верхний цветочек; (lf) ниже цветочек; (ra) рахилла; (фл) цветочек.

Колоски самок ids1 – mum также имеют больший размер из-за наличия лишних цветков (рис. D, E). Колоски нормальные женские содержат только один зрелый цветочек из-за аборта нижнего цветочка (Делонг и др., 1993). Развитие вторичных половых признаков у женских цветков включает в себя прерывание тычинок и развитие гинеция, на примере образования длинных шелков, состоящих из двух сросшихся плодолистиков (Randolph 1936). ids1 – mum1 колоски самок часто содержат более одного шелка, расположенного в эктопических положениях (Рис. D). Эти шелка, однако, обычно не развиваются нормально; они часто не сливаются и не удлиняются до нужной длины. Если проявляющееся ухо вручную после вскрытия и опыления развиваются несколько зерен, что позволяет предположить, что все другие аспекты оплодотворения и развития плодов нормальный. Когда они вырастают до зрелости, эти ядра демонстрируют гомозиготные фенотипы ids1 – mum и, следовательно, не представляют собой изъятия из зародыша элементов Mu .Аллель ids1 – mum2 кажется более серьезным, поскольку большинство лишних цветков не могут развить полностью сформированные боковые органы (Рис. E, слева). Приблизительно 5% из ids1 – mum2 женских колосков обнаруживают удлиненную рахиллу, выходящую из колоска (Рис. F). В таких случаях можно заметить, что рахилла не оканчивается верхним цветком, что еще раз подтверждает ее неопределенный характер. Нет очевидного и последовательного фенотипы наблюдались в листьях и корнях мутантов ids1 , несмотря на то, что ids1 экспрессируется в этих органах.

Анализ с помощью растровой электронной микроскопии

Сканирующая электронная микроскопия использовалась для определения точки, в которой развитие меристемы колосков ids1 – mum отличается от развития меристемы колосков дикого типа. Меристема соцветия обычно инициирует пару колосков. меристемы акропетально, которые, в свою очередь, разветвляются, образуя две меристемы колосков (рис.А) (Ченг и др., 1983). Меристемы колосков также разветвляются, образуя нижние и верхние соцветия. Эти цветочки образуют характерный узор, то есть, чередуя 180 градусов друг от друга (Рис. B). Хотя нижняя цветочная меристема инициирует сначала, боковой орган В верхнем цветке развитие происходит значительно раньше, чем в нижнем (рис. C, D). Палеа — первый боковой орган чтобы дифференцироваться, и вскоре после этого развиваются три тычинки (Cheng et al.1983). Половая дифференциация происходит на более поздних стадиях, на которых гинецей прерывается у мужских цветков, а тычинки — у самок. цветочки (Dellaporta, Calderon-Urrea, 1993).

Сканирующая электронная микроскопия нормальных и ids1 – mum2 ушей. ( A ) A632 зачаток уха с инициирующими зачатками пары колосков и зачатками колосков.Пруток, 300 мкм. ( B ) A632 неразветвленная меристема колосков ( верх, ) и несколько более старая ветвистая меристема колосков ( низ ). Более старая меристема колосков подвергается боковому ветвлению, инициируя нижний цветочек. Бар, 102 мкм. ( C ) Развитие боковых органов у ушных колосков A632. Сначала развиваются боковые органы верхнего цветочка. Пруток, 80 мкм. ( D ) Созревающие боковые органы верхнего цветочка ушных колосков А632 с инициирующим гинецким гребнем.Штанга, 104 мкм. ( E ) Ветвление ids1 – mum2 меристемы колосков. Самая верхняя меристема колосков еще не разветвлена ​​и выглядит удлиненной. Одновременное ветвление цветков и зарождение леммы происходит на противоположных сторонах средней и нижней меристем колосков. Штанга, 156 мкм. ( F ) Дальнейшее развитие меристем колосков ids1 – mum2 с удаленными чешуйками, что свидетельствует о развитии цветочных меристем в пазухах нижних конечностей. Колоск меристема сохраняется после каждого события ветвления.Пруток, 58 мкм. ( G ) Более старые ids1 – mum2 меристема колосков с удаленной чешуей. Остаточная меристема колосков удлиняется, образуя новый цветочек. Пруток, 60 мкм. ( H ) ids1 – mum2 колоск, показывающий созревающие боковые органы. Нет различия между верхним и нижним цветочками с точки зрения бокового органа. разработка. Самый молодой цветочек, отходящий от меристемы колосков, не виден леммой. Бар, 171 мкм. (spm) Колосок парная меристема; (см) меристема колосков; (lfm) нижняя цветочная меристема; (gy) гинецей; (fm) цветочная меристема; (ле) лемма.

ids1 – mum мутанты обнаруживают нормальное развитие до стадии, на которой меристема колосков начинает ветвиться. На этом этапе меристемы колосков ids1 – mum кажутся слегка удлиненными (Рис. E, вверху). В несколько более старых меристемах колосков (рис. E, в середине) два отчетливых события ветвления можно увидеть по наличию двух лемм (стрелок).Затем в пазухах этих леммы (рис. E, внизу и F). Эти события ветвления происходят на противоположных сторонах меристемы колосков по двоякой схеме. Меристема колосков сохраняется после каждого события ветвления и остается между двумя последними сформированными цветочками (Рис. G, H). Этот остаточная меристема колосков продолжает дистично инициировать дополнительные леммы и соцветия (рис. F, G). Скорость бокового органа Развитие между первыми двумя цветками ids1 – mum аналогично (рис.H), в отличие от дикого типа, у которого первыми развиваются органы верхнего цветочка.

Мы использовали ген гомеобокса узлов1 ( kn1 ) кукурузы, который экспрессируется в меристемах, а не в определенных боковых органах, для отслеживания событий ветвления. в ids1 — мама колосков. kn1 экспрессируется в меристемах колосков и цветков кукурузы (рис. A, B) (Jackson et al. 1994).Гибридизация с антисмысловым зондом kn1 на ids1-mum2 колосковых меристемах показала нормальную экспрессию внутри колосковой меристемы (Рис.C). Однако, как только меристема колосков ids1-mum2 разветвляется с образованием цветков, меристема колосков становится больше и, следовательно, домен экспрессии kn1 расширяется (Рис. D). Сильная экспрессия kn1 наблюдается внутри дополнительных цветков, начинающихся от меристемы колосков на более поздних стадиях (рис.E, стрелки) подтверждая меристематическое происхождение дополнительных соцветий. Все другие аспекты экспрессии kn1 внутри цветков, включая отсутствие в боковых органах и слое L1, кажутся нормальными.

Локализация in situ kn1 в меристемах колосков A632 и ids1 – mum2 .( A ) Экспрессия kn1 внутри неразветвленной меристемы колоска A632. Пруток, 50 мкм. ( B ) Экспрессия kn1 внутри ветвящейся меристемы колоска A632. Выражение можно увидеть в зарождающемся нижнем цветочке. Пруток, 50 мкм. ( C ) Экспрессия kn1 внутри неразветвленной меристемы колосков ids1 – mum2 . Пруток, 50 мкм. ( D ) Экспрессия kn1 в пределах раннего ветвления ids1 – mum2 меристемы колосков.По обе стороны от меристемы колосков видны зарождающиеся соцветия. Пруток, 60 мкм. ( E ) Экспрессия kn1 в более старом колоске ids1 – mum2 . Внутри развивающихся соцветий сохраняется сильное выражение. Пруток, 80 мкм. Стрелки указывают на зарождающиеся соцветия B, D, и E.

Анализ выражения

Первоначальная характеристика экспрессии ids1 с использованием гель-блоттинга РНК показала, что ген экспрессируется как в вегетативных, так и в цветочных тканях.РНК-гель блоттинг с 3′-частью кДНК ids1 показывает, что транскрипт ids1 присутствует во всех протестированных тканях (рис. A). Наименьшее количество экспрессии наблюдалось в ткани эмбриона, а наибольшее — в тканях эмбриона. в ткани соцветия.

Анализ экспрессии ids1 в различных органах кукурузы B73.( A ) РНК-гель-блот, содержащий 1 мкг поли (A) ⁺ РНК, выделенную из эмбрионов через 17 дней после опыления ( E ), меристемы побегов, включая нерасширенный стебель и зачатки самых молодых листьев ( M ), колос примордии соцветий длиной до 2 см ( I ), первичные корни из семян, проросших во влажном воздухе ( R ), и лопаточная часть полностью развернувшихся молодых листьев ( L ) были промоканы и гибридизированы с 3 ‘частью. кДНК ids1 , которая не включает домен AP2.( B ) Контрольная гибридизация. Блот в A зондировали кДНК убиквитина кукурузы, чтобы показать относительную нагрузку.

Для определения уровней транскрипта ids1 у мутантов ids1 – mum , поли (A) ⁺ РНК была выделена из мутантных ушей и сравнена с РНК из ушей дикого типа. Как показано на рисунке А, транскрипт размера дикого типа отсутствует. был обнаружен в аллеле ids1 – mum .Вместо этого наблюдались слабые транскрипты с более высокой молекулярной массой, которые могут быть результатом химерного или альтернативного склеенные транскрипты. Этот результат демонстрирует, что вставки элемента Mu в ids1 не сплайсируются, и что оба ids1 – mum1 и ids1 – mum2 могут представлять аллели потери функции.

Анализ экспрессии ids1 в ушах мутанта ids1 – mum .( A ) РНК-гель, содержащий 1 мкг поли (A) ⁺ РНК, выделенную из 2-сантиметровых ушей из A632 ( 1 ), ids1 – mum2 ( 2 ) и ids1 – mum1 ( 3 ) подвергали блоттингу и гибридизовали с 3′-частью кДНК ids1 . ( B ) Контрольная гибридизация. Блот в A зондировали кДНК убиквитина кукурузы, чтобы показать относительную нагрузку.

Для более точной локализации временного и пространственного паттерна экспрессии ids1 мы использовали гибридизацию in situ.На рисунке А показаны продольные срезы вегетативного побега дикого типа. apex зондировали меченной дигоксигенином антисмысловой РНК, полученной с 3′-конца клона ids1 . Положение листьев в побеге кукурузы было описано с помощью индекса пластохрона (Lamoreaux et al. 1978), в котором самый молодой лист обозначен как пластохрон 1 или P ₁ , а последующие листья — как P ₂ , P ₃ и т.д. Положение зарождающегося листа в меристеме обозначается как P ₀ . ids1 Экспрессия обнаруживается на боках меристемы в дискретной зоне (рис. A). С позиции самого молодого листа (обозначено как P ₁ ), мы предполагаем, что эта зона экспрессии меристемы находится в положении, в котором будет инициироваться следующий лист (обозначенный как P ₀ ). Выражение также наблюдается на кончиках следующих двух более старых листьев, P ₁ и P ₂ .

Локализация in situ в вегетативных и цветочных верхушках B73 с использованием 3′-части кДНК ids1 .( A ) Верхушечная меристема побега с молодыми зачатками листьев (P ₁ и P ₂ ) и зарождающимися зачатками листьев (P ₀ ). Пруток, 65 мкм. ( B ) Молодое соцветие початка. ids1 Экспрессия может быть замечена в акропетально инициирующих зачатках пары колосков. Пруток, 70 мкм. ( C ) Колосковые неразветвленные меристемы. Выражение можно увидеть в меристеме колосков, но не в чешуях. Пруток, 36 мкм. ( D ) Ветвящиеся меристемы колосков. Сильное выражение можно увидеть во внутренней и внешней леммах, а также в зоне между инициирующие верхние и нижние соцветия (стрелка без надписи).Эта зона экспрессии постепенно исчезает в более старом колоске. ниже. В инициирующих цветочных меристемах экспрессии не обнаружено. Пруток, 70 мкм. ( E ) Цветочек верхний с зарождающимися тычинками. Дискретные области экспрессии ids1 могут наблюдаться в инициирующих зачатках тычинок и палеа. ids1 Выражение сохраняется в расширяющихся внутренних и внешних леммах. Пруток, 70 мкм. ( F ) Старший цветочек с лодикулами. Выражение тычинок теперь локализуется в камерах локул пыльника.Никакого выражения не может быть замечено в лодикулах (ло). Пруток, 70 мкм. ( G ) ids1 – mum2 колоск, исследованный с помощью ids1. Мало или нет ids1 Расшифровка не может быть обнаружена. Стрелки указывают на цветочки. Пруток, 130 мкм.

В продольных срезах ткани цветков экспрессия ids1 обнаруживается в нескольких различных зачатках боковых органов, а также в паре колосков и меристемах колосков.На рисунке B продольные срезы меристем ранних соцветий, исследованные с помощью ids1 , демонстрируют полосы экспрессии в повторяющемся паттерне, который, очевидно, соответствует зачаткам пары колосков. На более позднем этапе после образования ножек и сидячих колосков экспрессия ids1 обнаруживается по всей меристеме колосков, но не в первых двух зачатках боковых органов, образованных из колоска. меристема, внешняя и внутренняя чешуйки (рис.C). Вскоре после зарождения цветковых меристем (рис. D) экспрессия ids1 присутствует в инициирующих внутренних и внешних листьях прицветника леммы, прилегающих к соцветиям, но отсутствует в зародыше. Сама цветочная меристема. Кроме того, в области между верхними и нижними цветочками видна сильная полоса экспрессии. (Рис. D, стрелка без надписи). У немного более старых колосков, как показано в нижней части рисунка D, эта полоса экспрессии начинается исчезнуть.Микрофотография колосков на эквивалентных стадиях, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, показана на рисунке В. В более зрелой кисточке. соцветия (Рис. E), дискретные группы клеток меристемы цветков, которые образуют тычинки, а палеа экспрессирует ids1. Экспрессия сохраняется на более поздних стадиях в более старых расширенных палеа и лемма, а также в камерах локул пыльника (рис. F). Небольшая экспрессия или отсутствие экспрессии наблюдались в жёлтых железах или гинеце уха (рис.F; данные не показаны). Как показано на рисунке G, когда зонд anti-sense ids1 используется на колосках ids1 – mum , экспрессия ids1 не обнаруживается.

Обсуждение

Регулирование количества цветков, инициированных меристемой колосков, является важным шагом в определении морфологии колосков.Мутации в гене ids1 влияют на детерминированность меристемы колосков. Вместо того, чтобы давать только верхний и нижний соцветия, меристема колосков ids1 – mum продолжает инициировать дополнительные соцветия в двухсторонней филлотаксии. Понимание того, как ids1 способствует детерминации меристемы колосков, требует изучения различных моделей инициации цветков кукурузы.

Одна модель зарождения цветков предполагает, что нижний цветочек начинается латерально, тогда как верхний цветочек — терминальный, в результате превращения меристемы колосков в верхний цветочек (рис.A) (ирландский язык, 1997 г.). У некоторых видов трав, таких как anthoxanthum, , колоск заканчивается цветком, а семяпочка является конечной структурой (Clifford 1987). Если верхний цветочек является терминальной структурой в нормальном развитии кукурузы, белок IDS1 может действовать, способствуя трансформации. меристемы колосков в верхний цветочек. IDS1 может делать это самостоятельно или посредством активации идентичности цветочной меристемы. гены, такие как ортологи LEAFY и APETELA1 , которые могут преобразовывать меристемы соцветий в цветочные меристемы (Mandel and Yanofsky 1995; Weigel and Nilsson 1995).Если бы это было так, мы бы предположили, что трансформация меристемы колосков в меристему цветков задерживается у мутантов ids1 – mum , позволяя меристеме колосков сохраняться и инициировать больше цветков. Такое толкование использовалось объясняют фенотип доминантных мутантов Ts6 кукурузы, у которых образуются лишние соцветия (Irish 1997). Мутанты Ts6 отличаются от мутантов ids1 – mum , однако, тем, что они также влияют на определение пола и вызывают отсутствие подавления плодолистых в кисточке, но не в ухо.

Модели для инициации цветков кукурузы. ( A ) Терминальный верхний цветочек. Колосковая меристема разветвляется один раз латерально, образуя нижний цветочек. Остаточный колоск затем меристема (показанная черным) трансформируется в верхний цветочек (черный). ( B ) Модель с боковым разветвлением.Меристема колосков имеет боковое ветвление, образуя нижние, а затем верхние соцветия. В остаточная меристема колосков (показана черным) находится в небольшой области между цветками. Зачаток колоска меристема находится в рахилле в зрелом колоске (черный).

Альтернативная модель предполагает, что и верхние, и нижние соцветия являются боковыми продуктами меристемы колосков.Два соцветия кукурузы интерпретируются как боковые ветви рахиллы с небольшим остатком оси или без остатка оси между ними цветочки (Bonnett 1953). Если ветвление верхнего цветочка латеральное, то в рахилле может быть обнаружен сильно редуцированный зачаток меристемы колосков. после зарождения верхнего цветочка (рис. Б). Согласно этой модели IDS1 будет участвовать в подавлении неопределенного роста внутри меристемы колоска, предотвращая регенерацию меристемы колоска после ветвления верхнего цветочка.У мутантов ids – mum остаточная меристема колосков пролиферирует и продолжает давать образование цветков.

На основе паттерна экспрессии ids1 и времени появления дефектов ids1 – mum , мы поддерживаем вторую модель и предполагаем, что функция IDS1 подавляет неопределенный рост в колоске. меристема. Согласно первой модели, переключение судьбы меристемы колосков происходит только после инициирования нижнего цветочка.Однако дефекты в меристемах колосков ids1-mum впервые наблюдались в меристемах колосков до зарождения нижних цветков (Рис. E). Сроки дефект предполагает, что изменение в детерминации судьбы происходит раньше, в соответствии с экспрессией ids1 , наблюдаемой в меристеме колосков до того, как происходит ветвление цветков (Fig. C). Первая модель также предполагает, что вся меристема колосков превращается в верхний цветочек, не оставляя остаточной меристемы колосков.Тем не менее, экспрессия ids1 была обнаружена в зоне между верхними и нижними соцветиями у дикого типа (рис. D), в которой остаточный колоск ожидается, что меристема будет локализована. Дополнительное свидетельство того, что эта область представляет собой остаточную меристему колосков, появляется. из наблюдения, что он регенерирует после ветвления цветков у мутантов ids1 – mum (Рис. F, G). Более того, ожидание от первой модели состоит в том, что ids1 будет выражаться по всему верхнему цветку будущего, чтобы способствовать его преобразованию в цветочную идентичность.Вместо этого, как показано на рисунке D мы не видим экспрессии ids1 ни в верхней, ни в нижней цветочной меристеме. Наконец, если бы детерминированность меристемы колосков просто была отложено у мутантов ids1 – mum в соответствии с первой моделью, можно было бы ожидать, что рахилла в конечном итоге оканчивается цветком. Это было не наблюдается ни у самца, ни у самки ids1 – mum колосков (рис. F; данные не показаны).

Считается, что развитие критического размера меристемы у кукурузы дает сигнал к возникновению ветвления (Sundberg and Orr 1996). Одним из механизмов, с помощью которого IDS1 может подавлять неопределенный рост, является ограничение размера остаточной меристемы колосков. такой, что он больше не может начинать соцветия. У мутантов ids1 – mum размер остаточной меристемы колосков может быть нарушен и увеличиваться до большего, чем обычно.Колоск большего размера меристема потенциально может позволить большему количеству событий ветвления произвести дополнительные соцветия. В поддержку этой идеи ids1 – mum меристема колосков кажется более удлиненной, чем обычно, до образования цветков (Рис. E). Также более крупная меристема колосков диаметр наблюдается вскоре после зарождения первого цветочка у мутантов ids1 – mum (Рис. D).

Однако важно понимать, что судьба меристемы не всегда зависит от размера меристемы.Например, верхняя Цветочная меристема намного больше, чем нижняя цветочная меристема во время инициации (Рис. B), и тем не менее обе они одинаково решил сделать цветочки. Таким образом, наличие более крупной меристемы колосков не обязательно наделяет ее большей неопределенностью. Не менее важным компонентом различия между определенными и неопределенными судьбами меристемы колосков является способность для восстановления после зачатия цветков.Меристемы с неопределенной судьбой могут проявлять большую способность к самовосстановлению. независимо от их первоначального размера. Измененная морфология, наблюдаемая в меристемах колосков у мутантов ids1 – mum , может быть просто отражением этой способности.

Возможно, что одним из способов, которым IDS1 функционирует для поддержания детерминированности меристемы колосков, является подавление этих необходимых факторов. для сохранения неопределенности.Ген гомеобокса kn1 экспрессируется в нескольких типах неопределенных меристематических тканей, но не в определенных органах, таких как листья. (Смит и др., 1992; Джексон и др., 1994). Мутанты с потерей функции kn1 кукурузы демонстрируют пониженное ветвление метелки и меньшее количество колосков. Постулировалось, что этот фенотип является результатом потери неопределенного клетки соцветия, которые в отсутствие kn1, приняли определенную судьбу (Kerstetter et al.1997). Если kn1 фактически поддерживает неопределенность меристемы, то экспрессия kn1 должна сохраняться в пределах меристемы колосков ids1 – mum и демонстрировать расширенный домен. Хотя это наблюдалось (Fig. D), важно отметить, что kn1 обычно экспрессируется как в колосковой, так и в цветочной меристеме (Fig. A, B). Таким образом, тот факт, что домен экспрессии kn1 расширяется у мутантов ids1 – mum , может просто отражать дополнительные области инициации цветков.

Ген ids1 был клонирован по гомологии с геном AP2 из Arabidopsis , и было показано, что он содержит два повтора высококонсервативного домена AP2. Хотя белок IDS1 показывает большее сходство с AP2 по сравнению со всеми другими AP2 -подобными генами, клонированными к настоящему времени, ген ids1 может не представлять фактический ортолог AP2 кукурузы.Гомология аминокислот между IDS1 и AP2 не распространяется за пределы домена AP2. Кроме того, экспрессия ids1 не была обнаружена в плодолистиках, как обнаружено для AP2 (Jofuku et al. 1994). Наконец, предварительные эксперименты показывают, что сверхэкспрессия кДНК ids1 в Arabidopsis не дополняет мутантный фенотип ap2-1 (G. Chuck unpubl.). Дополнительные члены семейства AP2 , вероятно, будут присутствовать в геноме кукурузы, поскольку гибридизации с низкой строгостью с доменом ids1 AP2 в качестве зонда на Саузерн-блоттингах кукурузы показывают несколько полос гибридизации (данные не показаны).Кроме того, несколько выраженных Было показано, что теги последовательностей из библиотек кДНК кукурузы содержат домены AP2 (Klucher et al. 1996).

Хотя ids1 экспрессируется в зачатках вегетативных и цветочных боковых органов, явных мутантных фенотипов в этих органах обнаружено не было. В этих органах может действовать определенный уровень генетической избыточности, который может быть обнаружен только путем анализа двойного мутанты.Например, двойные мутанты ap2 и aintegumenta обнаруживают фенотипы цветочных органов, не наблюдаемые ни у одного единственного мутанта в Arabidopsis (Elliot et al. 1996). Учитывая большое количество AP2 -подобных генов, присутствующих в геноме Arabidopsis (Okamuro et al. 1997), было бы неудивительно обнаружить такую ​​функциональную избыточность, имеющую место у кукурузы. Недавно было высказано предположение, что два тесно связанных гена MADS-бокса, zag1, и zmm2, играют избыточную роль в определении идентичности плодолистика и тычинок кукурузы (Mena et al.1996).

Хотя органы цветков ids1 – мама соцветий кисточки полностью функциональны и напоминают органы цветков дикого типа, дефекты органов цветков наблюдались у ids1 – мама женских колосков. Возможное объяснение этого дефекта может заключаться в том, что у нормальной самки происходит выкидыш нижнего цветочка. колоски. Если различие между верхними и нижними соцветиями утрачено у мутантов ids1 – mum , то все соцветия могут получить сигнал об прерывании беременности, который обычно присутствует только в нижних цветках дикого типа.Для проверки этой модели будет полезен анализ двойных мутантов с мутантом 2 , у которого не происходит выкидыша нижних цветков (DeLong et al. 1993).

В свете того факта, что многие представители семейства злаковых обладают неопределенными колосками, есть соблазн предположить, что AP2 -подобные гены играют роль в регулировании количества цветков у других трав. Колоски с множеством цветков считаются древним учитывая, что производные виды почти повсеместно эволюционировали, уменьшили количество цветков (Стеббинс, 1987).Возможный механизм такого снижения может включать изменение функции или домена экспрессии гена ids1 , чтобы включить меристему колосков в дополнение к различным латеральным органам, где она обычно экспрессируется. Анализ экспрессии ids1 как в современных, так и в древних травах будет интересно проанализировать в этом отношении.

Материалы и методы

Клонирование гена

Сорок тысяч бляшек библиотеки кДНК B73, построенных из ушей соцветий размером от 1 до 3 см (Jackson et al.1994) были исследованы при пониженной строгости при 55 ° C в 50% формамиде (Schmidt et al. 1993) с полноразмерной кДНК AP2 из Arabidopsis (Jofuku et al. 1994). Было выделено примерно 75 положительных клонов. Далее был проанализирован только самый сильный гибридизирующий класс. Представитель клон из этого класса был использован для исследования библиотеки кДНК вегетативной меристемы В73 (Lambda ZapII, Stratagene), из которой полноразмерный Была выделена кДНК размером 1,9 т.п.н. КДНК была субклонирована в pSK- и обе цепи секвенировали с помощью секвенатора ABI.Анализ последовательности было сделано с использованием GCG (Wisconsin Genetics Group) и сервера E-MAIL Национального центра биотехнологии.

Гель-блоты РНК и гибридизация in situ

выделяли из зародышей, ушей, вегетативных меристем и корней, как описано ранее (Kerstetter et al. 1994). Гибридизацию in situ проводили, как описано Jackson et al.(1994) с использованием 3′-концевого зонда между нуклеотидами 1330 и 1835 вне консервативного домена AP2 . Этот же фрагмент ДНК использовали для зондирования всех гель-блоттингов РНК. Наблюдается единственная полоса, гибридизирующаяся с этим зондом. на гель-блотах ДНК (данные не показаны), поэтому перекрестная гибридизация с другими членами семейства AP2 маловероятна.

Выделение рецессивных аллелей

Приблизительно 42000 растений F ₁ от скрещиваний между стадами, содержащими активные транспозиционные элементы Mu , выращивали и подвергали скринингу с помощью ПЦР в Pioneer Hi-Bred International для вставки в id1 (Bensen et al.1995) с праймером ZAP2-1 (5′-CCGGTGGCGCCAGCGAAGAA-3 ‘) и Mu-9242 (5′-CCCTGAGCTCTTCGTC (CT) ATAATGGCAATTATCTC-3’), вырожденный праймер, который связывается с концевым инвертированным повтором Mu. Реакции ПЦР проводили на гелях, блотировали и зондировали с помощью кДНК ID1 . Продукты ПЦР, которые гибридизуются с кДНК ids1 , идентифицировали людей, которые, вероятно, имеют вставки Mu в ген ids1 . Такой скрининг идентифицировал девять кандидатов с использованием праймера ZAP2-1.ДНК-гель-блот анализ расщепленной ДНК, полученной из самоопыляемое потомство каждого кандидата выявило полиморфизмы только для двух из девяти семейств при зондировании с помощью кДНК ids1 . Эти же два семейства были единственными, которые генерировали продукты ПЦР ids1 с использованием праймеров ZAP2-1 и Mu 9242. Вероятно, что семь других семейств, которые не показали полиморфизмов представляют собой события соматической вставки Mu в ids1 , которые не передались в зародышевую линию.Каждый аллель ids1 – mum был получен от скрещивания активной линии Mu и инбредной линии A632. Оба аллеля были однократно скрещены с A632 и подверглись самоопылению для наблюдения фенотипов. у гомозигот. Фенотипы также наблюдались после второго обратного скрещивания с A632 и обратного скрещивания с инбредным W23.

Сканирующая электронная микроскопия

Ткань фиксировали в FAA (50% этанол, 5% уксусная кислота, 3.7% формальдегида) при 4 ° C в течение ночи и обезвоживание в этаноле серию до 100%. Затем образцы были высушены до критической точки и напылены палладием. Образцы были просмотрены на ISI 30 РЭМ при ускоряющем напряжении 10 кВ.

Благодарности

Благодарим Дж. Окамуро и Д.Джофуку (Калифорнийский университет, Санта-Крус) за дар кДНК AP2 , Р. Керстеттеру за использование его РНК-блоттинга и К. Канаде (Pioneer Hi-Bred International) для идентификации вставок ids1 . Мы также признательны Э. Фоллбрехту, П. Макстину, Л. Райзеру, Ф. Хемпелю и сотрудникам лаборатории Хейка. за рецензирование рукописи и полезные обсуждения. G.C. был поддержан стипендией Калифорнийского университета. Работа поддержана Фондом Ю.S. Департамента сельского хозяйства и частично выполняется в рамках Совместных исследований и разработок. Соглашение с Pioneer Hi-Bred International, Inc.

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Эта статья должна быть настоящим помечены как «реклама» в соответствии с разделом 1734 18 USC исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

Семейства цветущих растений, UH Botany

Особенности и структура травы.

Идентификация травы
1 2 3 4

Трава

Spadix — обзор | Темы ScienceDirect

7 Дифференциация колосков

Дифференциация колосков начинается с появления цветочных зачатков. В то время как цветочные зачатки зарождаются в колоске, каждый зачаток цветка дифференцирует различные органы, составляющие цветочек (например,g., чешуйки у основания колоска, чешуи, чешуи, тычинок и пестика). В результате наступает период времени, в течение которого зачатки колосков, зачатки цветков и части цветков инициируются одновременно.

С началом зачатия цветочного зачатка происходит фундаментальное изменение морфологического паттерна развития колоса, которое сохраняется до физиологической зрелости. До этого момента зачатки листьев и колосков инициируются и развиваются акропетально. Однако базальные колоски не начинают дифференцироваться первыми.Цветки в средней и нижней части зрелого колоса (около позиций колоска 5–13) первыми начинают зарождение цветков, причем дифференциация колосков происходит как акропетально, так и базипетально из средней и нижней части. Существует некоторое несоответствие между основными (Кирби, 1974) или дистальными колосками (Whingwiri, Stern, 1982), дифференцируемыми первыми. Некоторое несоответствие происходит из-за того, что инициация начинается в нижней средней центральной области, что приводит к более вероятным дистальным, чем проксимальным, колоскам; таким образом, самые дистальные колоски могут начать дифференцироваться последними, если равномерное развитие происходит как акропетально, так и базипетально.Внутри колоска зачатки цветков начинаются акропетально. МС начинает формирование цветков раньше побегов.

Удлинение стебля только начинается (т.е. стебель меньше 5 мм, а его вершина находится ниже поверхности почвы), когда закладываются первые соцветия (Baker and Gallagher, 1983a; Nicholls, 1974). Это означало бы, что колоски начинают дифференцироваться очень скоро после двойного гребня, если предположить, что двойной гребень и начало удлинения междоузлий являются одновременными.

В литературе согласованы сообщения о том, что формирование цветков начинается до стадии TS, но сообщалось о значительных вариациях в количестве зачатков цветков на один колоск на стадии TS.Например, Кирби (1974, 1985) обнаружил около двух или трех цветков на колосках около средней и нижней части колоса на стадии TS. Whingwiri и Stern (1982) сообщают, что все колоски на стебле начали зарождение цветков до образования TS. Они заметили, что большинство четвертых цветков зародились между 1 и 8 днями после образования TS, обычно в течение 3 дней. Около 48% третьих цветков зародились до образования TS, 40% после TS, а остальные одновременно с TS. Время посева, по-видимому, не сильно изменило интервал между зарождением цветков и образованием TS.За некоторыми исключениями, поступление азота, по-видимому, способствовало зарождению цветков, но не формированию TS, хотя N не влияло на скорость или продолжительность зарождения цветков (Langer and Hanif, 1973; Whingwiri and Stem, 1982). У более поздних побегов меньше цветков зародилось до образования TS.

До того, как у Norin 10 и его производных произойдет значительное развитие цветков, чешуйки и зачатки чешуек разрастаются внутри колоска в большей степени, чем у стандартных сортов пшеницы (Fisher, 1973). Фишер объясняет это различие между генетическими линиями различиями в апикальном доминировании.Различия в апикальном доминировании могут объяснять различия в количестве зачатков цветков в колоске до появления зачатков тычинок, и то, что Norin 10 и его производные (т. Е. С большей склонностью к кущению и предположительно пониженным верхушечным доминированием) будут давать больше зачатков цветков перед тычинками. primordia зарождаются, чем у стандартной пшеницы (Fisher, 1973). Уильямс (1966a) дает относительные темпы роста, объемы, вес и длину различных органов колоса, а также всего колоса, показывает, что объем тычинок и плодолистиков в последовательных цветках внутри колоса меньше, и показывает, что продолжительность роста короче внутри колоса. последовательные соцветия; более короткая продолжительность следующих друг за другом цветков приводит к синхронности внутри колоса (Hay and Kirby, 1991).

Скорость развития колосков значительно варьируется в пределах колоса, при этом конечные колоски, центральные колоски, колоски чуть выше и ниже центральных колосков, а базальные колоски имеют последовательно снижающуюся скорость развития (Barnard, 1955). Однако это не абсолютный образец скорости развития спайков (Barnard, 1955). Кирби (1974) обнаружил, что разница в количестве цветков в колосках различалась не из-за разной скорости зарождения, а скорее потому, что продолжительность зарождения была короче у нецентрально расположенных колосков, а Кирби и Апплярд (1987) предполагают, что скорость зарождения цветков практически одинаков для всех колосков.Расчетная скорость зарождения цветков обычно колеблется от 0,02 до 0,04 цветков ° C ⁻¹ день ^−l (Kirby, 1974; Kirby and Appleyard, 1987; Whingwiri and Stern, 1982), или около 25 GDD между последовательными цветочками (Williams, 1966b). Температура и, возможно, свет являются основными факторами, влияющими на скорость развития колосков (Friend et al. , 1963; Hay and Kirby, 1991; Masle et al. , 1989a). Сообщается, что температура выше 30 ° C во время формирования цветков вызывает полную стерильность (Owen, 1971; Saini and Aspinall, 1982).

Максимум 8–12 инициалов зачатков цветков присутствует на каждом среднем центральном колоске и около 6–8 на базальных и дистальных колосках, но менее половины из них являются плодовитыми соцветиями в период цветения, потому что по крайней мере половина из них прерывается или развивается недостаточно до цветения, чтобы быть плодородным (Barnard, 1955; Engledow and Ramiah, 1930; Hay and Kirby, 1991; Herzog, 1986; Kirby, 1974,1985,1988; Kirby and Appleyard, 1987; Langer and Hanif, 1973; Siddique et al. , 1989; Single, 1964; Whingwiri, Stern, 1982).

Зарождение цветочных зачатков прекращается в нижних средних центральных колосках внутри шипа, когда начинает появляться флаговый лист (Baker and Gallagher, 1983a; Kirby, 1988). Неясно, прекращается ли зарождение цветочного зачатка одновременно для всех стеблей и всех колосков на стебле.

Прерывание цветков начинается при зарождении зародыша или когда флаговый лист полностью вырастает и зарождение цветков прекращается и длится около двух филлохронов, после чего дальнейший аборт цветков не происходит; аборт заканчивается примерно при заголовке или цветении (Kirby, 1985, 1988; Langer and Hanif, 1973; Siddique et al., 1989). Трудно предсказать, какие соцветия вырастут, но данные литературы согласуются с тем, что по крайней мере половина от общего числа инициалов цветков в колоске прервется или разовьется недостаточно для того, чтобы оплодотворить цветков. Whingwiri и Stern (1982) предполагают, что все соцветия, зародившиеся после формирования концевого колоска, не разовьют зерно.

Гибель цветков происходит в тот период, когда стебель и цветонос растут наиболее быстрыми темпами (Siddique et al. , 1989).Предпоследняя междоузлия находится на максимальной скорости роста, и скорость роста цветоноса быстро увеличивается. В течение этого периода площадь листьев медленно уменьшается, хотя общий уровень фотосинтеза может изначально не снижаться, особенно когда включен фотосинтез колоса. Кирби (1988) интерпретирует это как поддержку гипотезы о том, что гибель цветков частично происходит из-за конкуренции между колосом и стеблем за ресурсы, предположительно, углеводы. Одна из трудностей с этой гипотезой состоит в том, что во время этой фазы часто доступны избыточные углеводы, и эти углеводы хранятся в ткани междоузлий, хотя резервы обычно хранятся ближе к периоду, близкому к цветению или после него (Asana and Williams, 1965; Blacklow и другие., 1984; Джудель и Менгель, 1982; Wardlaw, 1970).

Барнард (1955) обрисовал гистогенез спайка и пришел к следующим выводам. Лиственный лист, чешуйчатая чешуя, лемма, палеа, лодикулы и плодолистик рассматриваются как листовые придатки. Тычинки, боковые зачатки колосков и цветочные зачатки считаются гомологами пазушным вегетативным побегам. Фишер (1973) согласился с этой интерпретацией.

Определение колоска по Merriam-Webster

Стерильные колоски улучшают урожай сорго и связанных с ним трав, показывает исследование

Большая часть еды, которую мы едим, поступает из злаков, таких как рис, пшеница, кукуруза, сорго и сахарный тростник.Эти культуры по-прежнему напоминают дикие виды, от которых они произошли. У всех трав структуры, содержащие цветы и семена, называются колосками.

В трибе Andropogoneae, основной группе трав, покрывающих 17 процентов поверхности земли, колоски встречаются парами, один из которых несет семя, а другой нет (хотя у некоторых видов он производит пыльцу).

Эта структура хорошо видна в сорго и многих диких травах, образующих прерии Северной Америки и африканские луга.

Заманчиво думать, что колоски, которые не дают семян, бесполезны, но тот факт, что они хранились в течение 15 миллионов лет, подразумевает, что они выполняют важную функцию.

Группа ученых Центра науки о растениях Дональда Дэнфорта в лабораториях под руководством доктора философии Элизабет (Тоби) Келлогг, члена и выдающегося исследователя Роберта Э. Кинга, и Дуга Аллена, доктора философии, ассоциированного члена и научного сотрудника Министерства сельского хозяйства США, собрались ответить вопросы; Может ли эта очевидно бесполезная цветочная структура захватывать и перемещать фотосинтетический углерод к семенам? И, в конечном итоге, заметим ли мы разницу в урожайности в случае удаления?

Исследователи использовали радиоактивные и стабильные изотопы углерода, РНК-последовательность метаболически важных ферментов и иммунолокализацию Рубиско, чтобы показать, что стерильный колоск собирает углерод из воздуха и осуществляет фотосинтез, в то время как ость — нет.

Отслеживая поток углерода, они обнаружили, что неплодородный колоск передает углерод семени, которое, по-видимому, использует его для получения энергии, накапливая его в семенах.

Когда они удалили бесплодный колосок из части ветвей растений сорго, они обнаружили, что вес семян (урожай) был ниже примерно на 10%. 9%.

Раньше мы думали, что эти цветочные структуры могут быть рудиментарными, но они оказались весьма ценным активом с точки зрения производительности .«

Тейлор Обюшон, первый автор исследования и старший техник, лаборатория Келлогга, Научный центр Дональда Данфорта

Результаты исследования «Стерильные колоски вносят вклад в урожай сорго и родственных трав» были недавно опубликованы в журнале Plant Cell . Дополнительные комментарии можно найти в Кратком обзоре.

«Это отличный пример того, как органы и структура растений могут вносить вклад в биомассу и урожай способами, не описанными ранее», — сказал Аллен.

«Этот проект был невероятно плодотворным благодаря тесному сотрудничеству, творчеству и целеустремленности всех, обмену опытом, планированию и проведению экспериментов и совместному анализу данных», — отметил Келлог.

В дополнение к уникальному сотрудничеству Келлог и Аллен также приписывают успех проекта опыту и передовым технологиям, предоставленным лабораториями Advanced BioImaging, Growth Plant, Proteomics и Mass Spectrometry в Danforth Center.

Следующим шагом будет определение того, в какой степени неплодородные колоски влияют на урожайность различных сортов полевых растений. Существующее разнообразие сорго может указывать на то, влияет ли размер неплодородного колоска на размер семян.

Источник:

Центр науки о растениях Дональда Дэнфорта

Ссылка на журнал:

AuBuchon-Elder, T., et al . (2020) Стерильные колоски способствуют повышению урожайности сорго и родственных трав. Растительная клетка .doi.org/10.