Французская коса из 5 прядей Французские косы
❤ 1347 , Категория: Французские косы, ⚑ Читайте также:Французская коса из 5 прядей
Сегодня мы освоим более сложное плетение. Пусть вас не пугают предполагаемые трудности. Для мастерицы, которая легко справляется с базовой французской косой, чуть более затейливое плетение — это и не проблема вовсе! А французская коса из 5 прядей выглядит настолько необычно и соблазнительно, что изучить это плетение стоит по многим причинам. Тут и желание приукрасить будни или праздники необычной прической на зависть всем подругам, и умение решать задачи, другим кажущиеся непосильными. Можете добавить к этому перечню также ваши личные мотивы, и приступим к уроку.
Для начала обрадуем вас тем, что все гораздо проще, чем кажется, когда смотришь на эту прическу в готовом виде. И французская коса из пяти прядей не занимает больше времени, нежели французская коса из 3 прядей. А освоить надо всего несколько повторяющихся шагов. Для начала не рекомендуется плести косу по всей голове, постепенно добавляя пряди. Можете даже попробовать на толстых нитях, чтобы разобраться. Можно облегчить себе задачу, если предварительно совсем немного увлажнить волосы.
Изучаем схему плетения косы из пяти прядей
1. Все волосы делим на пять равных частей. Плетение начинаем с того, что крайнюю левую прядь подводим под соседнюю с ней прядь, и располагаем над третьей слева.
2. Теперь у нас в левой руке три пряди, а в правой – две. Работаем каждый раз с той стороны, где прядей больше, кроме этого раза.
3. Самую правую прядь подводим под соседнюю прядь волос и располагаем поверх третьей справа (она же третья слева).
4. Теперь повторяем процесс поочередно, то слева, то справа.
Вот собственно и вся схема плетения. За счет того, что эта коса состоит из пяти прядей, она занимает достаточно широкое пространство на голове, и волосы кажутся предельно густыми и объемными.
Схема плетения французской косы из пяти прядей по всей голове
1. Располагаем косу посредине головы или по диагонали.
2. Начинаем работу с трех средних прядей на макушке.
3. Потом добавляем поочередно к крайним прядям тоненькие пасма волос сбоку. Чтобы это было делать удобней, вторую от края прядь поднимаем и закладываем на противоположную сторону.
4. Продолжаем добавлять пряди, пока свободных волос не останется.
5. Заканчиваем плетение, когда до кончиков волос останется несколько сантиметров.
Подобным образом можно плести две косы и больше. Поздравляем! Теперь вы знаете, что такое французская косичка из 5 прядей. Если Вас пугает количество прядей, то французская коса из 4 прядей — это то с чего следует начать.
Самое время усложнять и усовершенствовать эти превосходные навыки. Кто сказал, что французских кос может быть слишком много? Они ведь настолько хороши!
Источник: air-hair.ru
5 прядей Французская косаСхема плетения обратной косы с лентой из 5 прядей
Плетение этой косички с лентами, по сравнению с обычным плетением, достаточно трудное дело, которое требует мастерства и сноровки. Для классической схемы плетения такой косы, нужно уметь работать с 5-мя прядками.
Классическую косу с лентой можно плести как для повседневной жизни, так и на праздники, торжества и занятия спортом. Данная прическа может применяться универсально. Если у вас длинные волосы, но не достаточно густые, то обратная коса с лентами поможет вам создать именно толстую богатую косу.
Перед тем как приступить к работе, вам нужно освоить технику работы с пятью прядями, для создания обратной французской косы.
Схема плетения французской обратно косы из 5 прядей:
В нашей косе тремя прядями будут волосы, а двумя – два конца ленты, сложенной пополам. Чтобы понять принцип работы, смотрите на рисунок, где голубым цветом выделены прядки из ленты.
Подробное описание плетения обратной косы с лентой
Отделяем центральную прядь волос с макушки горизонтальным пробором. Далее следует закрепить середину ленты двумя невидимками над пробором (заранее вставьте ленту в одну из невидимок, а чтобы лента не соскользнула с заколки, можно капнуть каплю клея).
Центральную прядь помещаем между указательным и средним пальцами правой руки. Прядь слева помещаем под центральную. Между указательным и средним пальцами помещаем прядь, которая сейчас в центре.
Правой рукой поднимаем одну половинку ленты и укладываем ее под низ между большим и указательным пальцем. Прядь сверху снимаем и помещаем между указательным и средним пальцем. Поднимаем вторую часть ленты, и под нее укладываем прядь из левой руки.
Ленту снимаем и прижимаем к голове большим пальцем, прядь помещаем между указательным и средним пальцами и под нее укладываем прядь справа. Верхнюю прядь снимаем, а прядь находящуюся снизу помещаем между указательным и средним пальцами правой руки и под нее же укладываем ленту.
У нас получилось в правой руке одна прядь и лента, в левой руке две пряди, и между ними лента. Ленту с левой руки помещаем на указательный палец и под нее помещаем прядь, затем ленту снимаем и прижимаем к голове большим пальцем, одна прядь с левой руки уходит на указательный палец правой, вторая – между указательным и большим. Таким образом, мы освободили левую руку, чтобы захватить подплет с левого виска. Снимаем верхнюю прядь и продолжаем плетение, чтобы все пряди теперь оказались в левой руке и делаем подхват с правого виска.
Когда волосы для подплетов закончатся с обоих сторон, продолжаем плести обратную косу и 4-х прядей, до нужной длины. Собранную прическу необходимо закончить резинкой.
По желанию, можно добавить разнообразные украшение дополняющие прическу, которые будет на контрасте с одеждой, или наоборот, в тон ей. Здесь вы можете дать волю фантазии и предпочтениям.
Как правильно вплетать ленту в косу
Коса с вплетением ленты может иметь разное расположение, например, на одну сторону, по диагонали, вплетение в косу посередине и другие различные варианты. Французская обратная коса из 5 прядей выглядит более элегантно, если вплести в нее ленту. Необычная косичка с лентой выходит при формировании богемной косы, либо косы корзинки. Цвет ленты выбирается в тон аксессуарам, одежды, либо он может перекликаться с вашими глазами. Ширину ленты также можно выбрать на ваше усмотрение. Для более легкого плетения используйте один конец ленты, тогда вам нужно будет работать только с 4-мя прядями.
Так же используя ленту нужно помнить, что широкая лента визуально делает голову больше, а узкая подчеркивает нежность и изящность женской головки. Цвета также имеют большое влияние, яркие цвета подходят девушкам с правильным профилем, изящными ушами и длинной привлекательной шеей, так как они делают акцент на форму головы. В противном случае лучше воспользоваться ленточкой пастельных тонов, они не будут привлекать внимание, но придадут изящество модной прическе.
Косичка из 5 прядей: техника плетения, рекомендации.
Автор DearHair На чтение 4 мин. Просмотров 295 Опубликовано
Косичка из пяти прядей – это разновидность французской прически, которая дает безграничный полет фантазий для создания нового образа. Косы пользуются огромной популярностью из года в год. Однако прической из 3 и даже из 4 прядей уже никого не удивишь, а вот из пяти – можно создать различные варианты образов для различных выходов.
Подобное плетение лучше всего смотрится на длинных волосах – как тонких, так и густых. На мелированных – коса выделяется по-особенному четко и красиво. Такая выпуклая объемная коса придает лицу таинственный, строгий и одновременно игривый вид.
Пятипрядочное плетение подойдет как к повседневному, деловому выходу, так и к вечернему. С любым нарядом оно будет смотреться великолепно – будь то платье или строгий костюм.
Особенной популярностью такие косы пользуются у невест. Чтобы ажурное плетение выглядело более женственно и торжественно, в него добавляют камушки или цветы. Техника плетения из пяти прядей более сложная, чем из трех. Но если в ней хорошо разобраться и немного попрактиковаться, каждый сможет сделать такую косу самостоятельно.
Техника исполнения
Для классического плетения, которое начинается с макушки или ото лба, необходимо выполнить такие шаги:
- Разделите локоны на пять тонких прядей. Первые три зажмите в левой руке, а остальные две — в правой.
- Заведите первую прядку между двумя последующими так, чтоб вторая была сверху, а третья снизу от первой.
- Заведите пятую веревку (прядь) под четвертую.
- Затем четвертую пропустите над первой. В итоге четвертая будет расположена параллельно третьей и второй.
- Аналогично второму действию – заведите вторую между третьей и пятой. Третья будет лежать сверху, а пятая должна получиться снизу.
- Запустите четвертую прядку под первую и сверху второй. В итоге четвертый локон будет параллелен пятому и третьему.
- Теперь вы получили два однородных сегмента ажурного плетения. Продолжайте работу, используя 2, 3 и 4 пункты.
- Окончить плетение можете как на самых кончиках волос, так и на середине длины. С помощью первого варианта вы подчеркнете густоту и длину ваших волос, если обладаете таковыми. Если локоны тонкие – остановитесь на втором варианте.
- Закрепите плетение красивой заколкой. Если остался свободный хвост, можете его завить.
Такая коса выглядит очень нарядно, как кружево, и создает дополнительный объем волос на голове.
Освоив шахматку из пяти прядок, можете пробовать вплетение в косу различных аксессуаров. Давайте рассмотрим один из таких возможных вариантов.
Ленты
Очень привлекательно и неповторимо смотрится коса с двумя вплетенными лентами. Техника ее создания совпадает с приведенной выше инструкцией. Однако здесь нужно заменить несколько прядей двумя ленточками или цветными нитями.
Порядок действий:
- У основания косы закрепите две ленты с помощью невидимок.
- Разделите пучок так, чтобы получить последовательность из двух прядок, пары нитей и еще одной прядки.
- Первый пучок запустите под второй и над первой лентой, а затем еще пустите его под вторую ленточку.
- Повторите подобные действия с другой стороной.
- Если вы начали плетение с макушки, то продолжайте работу, добавляя тонкие пучки с левой и правой стороны поочередно. Нужно использовать все волосы.
- Зафиксируйте косу на желаемой длине.
- Чтобы сделать косу более ажурной и объемной, аккуратными и легкими движениями расправьте крайние локоны. Главное, не переусердствуйте, поскольку можете повредить косу – локоны начнут выбиваться из прически, и она быстро распадется.
Рекомендации
Поскольку косу такого типа выполнить нелегко, воспользуйтесь советами:
- Если вы новичок в подобном плетении, сначала потренируйтесь на простой французской косе.
- На каскадную стрижку косу лучше не доплетать до кончиков, ограничьтесь длиной до шеи.
- После того как вы приобретете все необходимые навыки, включайте фантазию. Заплетайте прическу вокруг головы, наискось, сворачивайте косу в цветок, делайте проборы в разном направлении.
- Можно делать две косы, затем соединить их в одну или осуществить зеркальное плетение, запустив первую прядку ниже второй и выше третьей.
- Если у вас вьющиеся волосы, попробуйте создать романтическую гофрированную прическу или выпрямите их для создания более элегантной косы.
- Чтобы сделать прическу более торжественной, добавьте аксессуары.
В общем, многое зависит от вашего воображения и желания. Но помните, что ажурная коса в любом исполнении смотрится потрясающе. В таком образе вы не останетесь незамеченной.
«Техника плетения косы из пяти прядей».
Тема: «Техника плетения косы из пяти прядей».
Цель и задачи:
— Расширение кругозора обучающихся в мире причесок и современных тенденций плетения косичек.
— научить учащихся заплетать косу данного вида;
— способствовать формированию и развитию умений и навыков по уходу за собой, своими волосами;
— воспитывает аккуратность
Оборудование:
Расческа-щетка. Расческа с разделителем на конце. Спрей для волос или лак.
Резинка или заколка, чтобы закрепить 5 прядок.
Тип учебного занятия: комбинированный
Форма проведения занятия: мастер-класс
Методы обучения: объяснительно — иллюстративный, эвристический,
демонстрационный, практический, метод мотивации и стимулирования.
Педагогические технологии: проектная деятельность, педагогика сотрудничества
Подготовительная работа:
1. Работа с литературой.
2. Работа с Интернет сайтами.
3. Подбор иллюстраций.
4. Написание конспекта.
Ход учебного занятия
Организационный момент занятия
Педагог: У нас сегодня мастер-класс «Техника плетения косы из пяти прядей».
В программе мастер-класса:
Историческая справка о появлении профессии парикмахера.
Появление косичек в истории.
Рекомендации по уходу за волосами.
Современные техники плетения косы из пяти прядей.
Основная часть занятия
Сообщение темы, цели, задач занятия.
Педагог: А знаете ли вы кто такие парикмахеры?
Обучающиеся: отвечают на вопрос.
Педагог: Сейчас я вам немного напомню, кто же такие парикмахеры и откуда они появились?
Педагог: История парикмахерского искусства насчитывает тысячелетия. Как ни странно, прическа появилась в первобытном обществе намного раньше, чем одежда. Уже в V тысячелетии до нашей эры люди уделяли немалое внимание уходу за волосами. Прическа в далеком прошлом не только украшала человека, но и подчас была знаком профессии, социального происхождения, национальной принадлежности, а в особых случаях даже политической принадлежности. Каждая эпоха вносила что-то новое в развитие парикмахерского искусства, которое отражало быт и нравы каждого народа, представление людей о красоте. Уже в первобытном обществе человек вынужден был выполнять простейшие парикмахерские процедуры: подрезал волосы кремневым ножом, обжигал над пламенем. Мужчины связывали волосы в пучки кожаным ремешком, женщины скручивали волосы в жгуты, плели косы.
Первые признаки парикмахерского искусства встречаются примерно в V тысячелетии до нашей эры у египтян.
Египтяне уже делали завивку волос и париков при помощи холодной («мокрой») укладки. Пряди наматывали на деревянные коклюшки и обмазывали грязью, по высыхании грязь отваливалась. Туалетные процедуры выполнялись рабынями, причём каждая имела свою специальность.
В Греции причесывание, завивка, надевание парика являлись своеобразным ритуалом, который длился иногда по нескольку часов. Эти процедуры выполнялись специально обученными рабынями, которых называли каламистрами. Каждая процедура — мытье, окраска, завивка, стрижка волос — выполнялась раздельно.
Рабы-парикмахеры должны были не только умело причесать, но и соблюсти правила эстетики. Они должны были выдержать пропорцию, гармонию прически с чертами лица.
Педагог: А сейчас учащиеся дадут вам полезные рекомендации:
Обучающиеся: (дают рекомендации)
Рекомендация по уходу за волосами
-ухаживать за волосами, не обходимо вне зависимости от длинны и структуры волос, волосы должны выглядеть здоровыми, т.е. мягкими, блестящими и ровными по структуре.
— прежде всего волосы необходимо правильно мыть, по мере загрязнения, частое мытьё волос так же вредит, так как волос и кожа теряет свои жиры, которые являются природными бальзамами и защищают от вредного воздействия солнечных лучей.
— расчесывать волосы рекомендуют после того, как они высохнуть естественным путем (частое использование фена не рекомендуется, волосы становятся тусклыми и ломкими) и применяют пластмассовые, деревянные расчески и щетки из натуральной щетины. Правильно начинать расчесывать с кончиков и плавно переходить к корням волос, не делать резких движений, есть риск порвать структуру волос.
-средства по уходу за волосами, это шампуни, бальзамы, ополаскиватели, желательно использовать все в комплексе, так же можно использовать маски, масла и разные травяные отвары, средства для укладки это лаки, гели, муссы, воски. Желательно использовать эти средства не часто и по возможности смывать через несколько часов теплой водой, а затем уже мыть голову и волосы.
Педагог: Спасибо девочки
Педагог: Правильно парикмахеры должны уметь разбираться в структуре волоса, правильно подобрать прическу и стрижку для клиента или модели, уметь пользоваться средствами по уходу за волосами, средствами для укладки и фиксации.
Педагог: А теперь познакомимся с техникой плетение косичек из пяти прядей. На сегодняшний день эта техника наиболее модная и очень разнообразная…внимание на экран (слайды)
Педагог: А теперь пришло время для творчества. Приступаем к мастер-классу по техники плетения косы из пяти прядей.
Обучающиеся: Для демонстрации и защиты вам необходимо время.
Педагог: И так наши модели готовы. Прошу вас (1ая пара)
Прошу вас (2 пара), прошу вас(3 пара)
Рефлексия
Педагог: А сейчас я предлагаю вам, девочки, поделиться своими впечатлениями о сегодняшнем нашем занятии и о проектах, которые вы готовили и защитили.
Обучающиеся: говорят свои впечатления
Педагог: Отлично, я уверена, что всё то, чему вы научились сегодня, вы обязательно примените в своей обычной жизни. Спасибо вам большое! До свидания!
Практическая работа
Последние годы вернули модницам всего мира классическую косу как символ элегантности и красоты. Разнообразие вариантов – от обыкновенной до шикарных экстравагантных многопрядных кос, французских, датских, шахматных – стало не только делом стилистов по прическам. Постепенное овладение высоким искусством парикмахерского мастерства завладело тысячами поклонниц таких укладок
Коса этого фасона выглядит очень сложной прической, но на самом деле заплести ее совсем не сложно. Чтобы коса этого фасона смотрелась эффектно и нарядно, ее следует плести из прядей достаточно длинных волос.
1.Начинайте перекрещивать первые пряди как при плетении обыкновенной косы: пропустите левую прядь между второй и третьей, оставив №2 под узором, а третью положив сверху на первую.
2. Крайнюю правую прядь проводим над соседней четвертой, скрещивая с крайней левой под номером 1.
3. Объединяем в общий рисунок 2, 3 и 5 пряди. Вторую прядь вплетаем над третьей, прикрываем пятой прядью.
4.Пришло время задействовать 4 прядь: пропускаем над первой прядью, заводя под вторую прядь.
5.Продолжаем плетение по выбранной схеме с первого этапа.
Открытое занятие по теме: «Современные техники плетения косы из пяти прядей» | План-конспект занятия на тему:
Муниципальная бюджетная организация дополнительного образования
«Центр компетенций «Импульс» г. Усть-Лабинска
муниципального образования Усть-Лабинский район
Открытое занятие
по теме: «Современные техники плетения
косы из пяти прядей»
Автор — составитель:
педагог дополнительного образования
Гуржиянц Людмила Юрьевна
2014 г.
Тема: «Современные техники плетения косы из пяти прядей»
Цель: Расширение кругозора обучающихся в мире причесок и современных тенденций плетения косичек.
Задачи:
1. Познакомить обучающих с историей появления косичек.
2. Научить обучающих технике плетения кос.
3. Развивать умение воплощать свои творческие ассоциации в разных техниках плетение косичек.
4. Развивать умение создавать из косичек прически.
5. Воспитывать интерес к занятиям по стилистики.
Тип учебного занятия: комбинированный
Форма проведения занятия: мастер-класс
Время занятия: 45 минут
Участники занятия: учащиеся общеобразовательных школ 1-го года обучения
Методы обучения: объяснительно — иллюстративный, эвристический,
демонстрационный, практический, метод мотивации и стимулирования.
Педагогические технологии: проектная деятельность, педагогика сотрудничества
Методическое обеспечение занятия: Презентация «история косичек».
Оборудование: мультимедийное оборудование.
Подготовительная работа:
1. Работа с литературой.
2. Работа с Интернет сайтами.
3. Подбор иллюстраций.
4. Оформление слайдовой презентации.
5. Написание конспекта.
Ход учебного занятия
I. Организационный момент занятия
Педагог: У нас сегодня мастер-класс «Современные техники плетения косы из пяти прядей ». В программе мастер-класса:
- Историческая справка о появлении профессии парикмахера.
- Появление косичек в истории (презентация).
- Рекомендации по уходу за волосами.
- Современные техники плетения косы из пяти прядей.
II. Основная часть занятия
1. Сообщение темы, цели, задач занятия.
Педагог: А знаете ли вы кто такие парикмахеры?
Обучающиеся: отвечают на вопрос.
Педагог: Сейчас я вам немного напомню, кто же такие парикмахеры и откуда они появились?
Педагог: История парикмахерского искусства насчитывает тысячелетия. Как ни странно, прическа появилась в первобытном обществе намного раньше, чем одежда. Уже в V тысячелетии до нашей эры люди уделяли немалое внимание уходу за волосами. Прическа в далеком прошлом не только украшала человека, но и подчас была знаком профессии, социального происхождения, национальной принадлежности, а в особых случаях даже политической принадлежности. Каждая эпоха вносила что-то новое в развитие парикмахерского искусства, которое отражало быт и нравы каждого народа, представление людей о красоте. Уже в первобытном обществе человек вынужден был выполнять простейшие парикмахерские процедуры: подрезал волосы кремневым ножом, обжигал над пламенем. Мужчины связывали волосы в пучки кожаным ремешком, женщины скручивали волосы в жгуты, плели косы.
Первые признаки парикмахерского искусства встречаются примерно в V тысячелетии до нашей эры у египтян.
Египтяне уже делали завивку волос и париков при помощи холодной («мокрой») укладки. Пряди наматывали на деревянные коклюшки и обмазывали грязью, по высыхании грязь отваливалась. Туалетные процедуры выполнялись рабынями, причём каждая имела свою специальность.
В Греции причесывание, завивка, надевание парика являлись своеобразным ритуалом, который длился иногда по нескольку часов. Эти процедуры выполнялись специально обученными рабынями, которых называли каламистрами. Каждая процедура — мытье, окраска, завивка, стрижка волос — выполнялась раздельно.
Рабы-парикмахеры должны были не только умело причесать, но и соблюсти правила эстетики. Они должны были выдержать пропорцию, гармонию прически с чертами лица.
Педагог: А сейчас учащиеся дадут вам полезные рекомендации:
- по уходу за волосами;
Обучающиеся: (дают рекомендации)
Рекомендация по уходу за волосами
-ухаживать за волосами, не обходимо вне зависимости от длинны и структуры волос, волосы должны выглядеть здоровыми, т.е. мягкими, блестящими и ровными по структуре.
— прежде всего волосы необходимо правильно мыть, по мере загрязнения, частое мытьё волос так же вредит, так как волос и кожа теряет свои жиры, которые являются природными бальзамами и защищают от вредного воздействия солнечных лучей.
— расчесывать волосы рекомендуют после того, как они высохнуть естественным путем (частое использование фена не рекомендуется, волосы становятся тусклыми и ломкими) и применяют пластмассовые, деревянные расчески и щетки из натуральной щетины. Правильно начинать расчесывать с кончиков и плавно переходить к корням волос, не делать резких движений, есть риск порвать структуру волос.
-средства по уходу за волосами, это шампуни, бальзамы, ополаскиватели, желательно использовать все в комплексе, так же можно использовать маски, масла и разные травяные отвары, средства для укладки это лаки, гели, муссы, воски. Желательно использовать эти средства не часто и по возможности смывать через несколько часов теплой водой, а затем уже мыть голову и волосы.
Педагог: Спасибо девочки
Педагог: Правильно парикмахеры должны уметь разбираться в структуре волоса, правильно подобрать прическу и стрижку для клиента или модели, уметь пользоваться средствами по уходу за волосами, средствами для укладки и фиксации.
Педагог: А теперь познакомимся с техникой плетение косичек из пяти прядей. На сегодняшний день эта техника наиболее модная и очень разнообразная…внимание на экран (слайды)
Педагог: А теперь пришло время для творчества. Приступаем к мастер-классу по техники плетения косы из пяти прядей.
Обучающиеся: Для демонстрации и защиты вам необходимо время.
Педагог: И так наши модели готовы. Прошу вас (1ая пара)
Прошу вас (2 пара), прошу вас(3 пара)
Рефлексия
Педагог: А сейчас я предлагаю вам, девочки, поделиться своими впечатлениями о сегодняшнем нашем занятии и о проектах, которые вы готовили и защитили.
Обучающиеся: говорят свои впечатления
Педагог: Отлично, я уверена, что всё то, чему вы научились сегодня, вы обязательно примените в своей обычной жизни. Спасибо вам большое! До свидания!
Best Fiber Pigtial от AmeriFiber
Волоконно-оптические кабели являются важными компонентами крупномасштабных оптоволоконных сетей. В отличие от оптоволоконных перемычек, которые имеют заводские разъемы на обоих концах, патч-корды с косичками имеют только один разъем — другой конец — это оптоволокно без оконечной нагрузки.
Многопроволочные косички содержат несколько плотно буферизованных волокон в оболочке кабеля, которые можно легко разрезать, сращивать и заделывать. Это позволяет организациям быстро настраивать и развертывать оптоволоконные гибкие кабели для сетевых терминальных приложений.Вместо того, чтобы подбирать подходящий разъем для каждого конца соединительного кабеля, компании могут просто отрезать и соединить косички по запросу.
Зачем использовать оптоволоконный кабель с косичками?
Не для каждого промышленного или производственного применения требуется патч-корд с предварительно заделанными разъемами на обоих концах. Во многих случаях компаниям нужны заводские разъемы только на одном конце. На другом терминале легче использовать сварку или механическое соединение цифровых соединений, особенно если они являются частью более крупной панели, сети или развертывания оптоволокна.Решения с косичками также идеальны при прокладке оптоволоконного кабеля через ограниченные пространства и внутренние каналы.
Хотя можно просто купить и разрезать оптоволоконный патч-корд с разъемами на обоих концах на два гибких оптоволоконных кабеля, это создает две потенциальные проблемы — стоимость и сложность. Кабели с двумя разъемами часто дороже, чем их аналоги с пигтейлами, а неточные обрезки существующих коммутационных шнуров могут вызвать сбои оптоволоконных пигтейлов. Специально разработанный патч-корд с гибким хвостовиком обеспечивает производительность и пропускную способность, необходимые для дорогостоящих оптоволоконных приложений.
Многожильный волоконно-оптический кабель с гибкими выводами позволяет легко прокладывать большие объемы прядей по защищенному пути или длине внутреннего канала с легкими соединениями на одном конце и несколькими вариантами сращивания на другом. Это обеспечивает большую гибкость для приложений большого объема, таких как телекоммуникационная сигнализация или управление промышленными устройствами, наряду с уменьшением площади кабельной проводки, поскольку несколько нитей могут быть развернуты в одной оболочке.
Выбор наиболее подходящего оптоволоконного кабеля
Компания Amerifiber предлагает решения как для многомодового, так и для одномодового оптоволоконного кабеля для удовлетворения потребностей вашей сети.Наши многожильные многомодовые пигтейлы доступны с разъемами LC, SC, ST, FC и MPO для приложений 62,5 / 125 и 10 гигабайт, в то время как наши многожильные одномодовые пигтейлы включают варианты SC, LC, ST, FC, MU и MPO. и доступны с наконечниками UPC или APC.
Не уверены, что лучше всего подходит для вашего приложения? Используйте свои объемы данных и расстояния в качестве ориентира. Многомодовые косички обеспечивают перенос больших объемов за счет использования стеклянных нитей большего диаметра. Но на больших расстояниях эти многомодовые оптоволоконные сигналы начинают преломляться и ухудшаться.Одномодовые пигтейлы используют гораздо меньшие жилы из стекловолокна с сердцевиной для передачи высококачественных данных меньшего объема на большее расстояние.
Идите дальше с оптоволоконным кабелем
В Amerifiber мы стремимся создавать и поставлять на рынок самые качественные оптоволоконные кабели. Благодаря непревзойденной прочности и надежности — и более чем 30-летнему опыту работы в отрасли — наша цель — предлагать лучшие и наиболее конкурентоспособные цены на каждый продукт, который мы поставляем.Мы производим каждый кабель в соответствии со спецификациями клиентов, чтобы наилучшим образом подходить к применению.
Улучшите производительность сети и оптимизируйте ее с помощью правильных волоконно-оптических кабелей. Свяжитесь с Amerifiber сегодня.
11 способов носить плетеные косички, которые не выглядят по-детски
Добро пожаловать в Selfmade Finance School, нашу новую денежную серию с Block Advisors , чтобы круглый год помогать владельцам малого бизнеса с их налоговыми, бухгалтерскими и расчетными потребностями. На этой неделе мы рассмотрим пять различных типов предприятий, которые вы можете рассмотреть для своего малого бизнеса.
При открытии собственного дела нужно учитывать миллионы вещей. Некоторые из них очень захватывающие и гламурные — «Какое классное имя дать нашему бизнесу?», «Какой забавный логотип выбрать?». Некоторые решения, которые мы принимаем, не так гламурны, но не менее важны! Здесь я сосредоточусь на не очень забавных решениях, которые вам нужно принять при открытии своего бизнеса.
Каким нам следует быть?
Многие новые владельцы бизнеса часто не могут решить, как открыть свой бизнес.Во-первых, я предлагаю поговорить с налоговым специалистом или юристом, прежде чем вы примете это решение. Все предприятия работают по-разному, и когда вы пытаетесь принять это решение, вам необходимо учитывать, какой тип бизнеса вы ведете, сколько людей задействовано и как выглядит ваша личная налоговая ситуация. Вот несколько примеров организаций, которые следует учитывать:
Индивидуальный предприниматель: Если вы управляете бизнесом самостоятельно, а бизнес не является юридическим лицом, вы, скорее всего, являетесь индивидуальным предпринимателем.Индивидуальные предприниматели должны заполнить индивидуальную налоговую декларацию, используя Таблицу C, которая будет служить отчетом о прибылях и убытках (P&L). Это будет включать в себя все ваши доходы от бизнеса и ваши расходы. Вы должны подавать Приложение C в личный кабинет 1040 до 15 апреля каждого года. Помимо обычного подоходного налога, индивидуальный предприниматель будет платить налоги на самозанятость по той же ставке, что и доля работника и работодателя в налогах на социальное обеспечение и медицинскую помощь. Преимущество этого бизнес-объекта — простота; нет необходимости создавать отдельное юридическое лицо или подавать отдельную налоговую декларацию.
«Вы можете прекратить и начать индивидуальное предпринимательство в любое время, так что это хороший способ намочить ноги, пока вы исследуете, будет ли ваш бизнес успешным», — говорит Марси Ран, главный налоговый консультант и зарегистрированный агент Block Advisors. .
Партнерство: Партнерство состоит из двух или более человек, работающих вместе в торговле или бизнесе. Каждый человек вкладывает деньги, имущество, труд или навыки и рассчитывает разделить прибыль и убытки. Партнерство должно подавать ежегодный информационный отчет по форме 1065, срок подачи которого истекает 15 марта.Партнерство не платит налоги на уровне хозяйствующего субъекта, а вместо этого передает прибыль и убытки партнерам. Затем каждый партнер сообщает о своей доле и платит налоги со своей индивидуальной прибыли. Налоговые последствия будут различаться в зависимости от ситуации с личным доходом каждого партнера.
Фото You X Ventures на Unsplash
C Corporation: C-Corp — это организация, созданная в соответствии с законами штата, федеральными законами или законами об иностранных корпорациях.У C-Corp есть акционеры, которые выбирают директоров, и директора управляют корпорацией. Офицеры и менеджеры, нанятые этими директорами, выполняют повседневную работу бизнеса. C-Corps должен платить налоги с любой полученной прибыли. C-Corps будет использовать форму 1120 и подавать ее к 15 апреля. Акционеры также будут платить налоги на любые распределенные дивиденды при подаче индивидуальной налоговой декларации, поэтому корпоративный доход имеет элемент двойного налогообложения. Однако C-Corp действительно отличается от своих владельцев и сотрудников и может иметь неограниченную жизнь.
S Corporation: S-Corp — это корпорация, которая делает выборы в подразделе S. Это должен быть отечественный бизнес с числом акционеров не более 100. Вы даже можете быть одиночной S-корпорацией. У этой организации есть только один класс акций. S-Corps заполнит форму 1120S, чтобы сообщить о любой прибыли. Он должен быть подан до 15 марта. Он не облагается налогом, как C-Corp, но, как партнерства, доходы и убытки передаются акционерам, которые сообщат о налоговых последствиях в своей индивидуальной налоговой декларации.Если вы работаете на S-corp, вы будете платить себе разумную заработную плату за свои услуги, которые облагаются налогами на социальное обеспечение и Medicare, но дополнительная прибыль от бизнеса облагается налогом как обычный доход. «Бывают ситуации, когда самозанятые лица могут использовать S-Corp, чтобы сэкономить на налогах на самозанятость, поэтому вы можете изучить эти варианты по мере роста вашего бизнеса», — говорит Ран.
Общество с Ограниченной Ответственностью: ООО — это юридическое лицо, с которым можно работать по-разному.Хотя ООО обеспечивает юридическую защиту бизнеса, у него нет особой налоговой формы, как у других хозяйствующих субъектов. Вместо этого IRS смотрит не только на название LLC, но и на то, сколько членов у LLC и есть ли выборы для подачи налоговой декларации в качестве конкретного вида бизнеса. Правило по умолчанию рассматривает LLC с одним участником как индивидуального предпринимателя в налоговых целях.
Если LLC состоит из двух или более участников, правило по умолчанию рассматривает его как партнерство для целей налогообложения. LLC также может выбрать, чтобы ее рассматривали как C- или S-Corp, и подавать налоги, как эти организации.Распространенным заблуждением является то, что все индивидуальные предприниматели должны образовывать LLC, но это не так. Хотя статус ООО не дает никаких налоговых льгот, правовая защита может быть важна для предприятий любых форм и размеров.
Фото You X Ventures на Unsplash
Выберите календарный год
Это странный год, но вы должны об этом подумать. В большинстве предприятий используется календарный год (с 1 января по 31 декабря), который легко согласуется с датами ваших личных налоговых деклараций и налоговых документов.Однако финансовый год может быть лучше для вашего бизнеса. Например, если вы работаете в отрасли с высокой сезонностью, вы можете подвести итоги года после окончания сезона. Финансовым годом могут быть любые 12 последовательных месяцев, которые заканчиваются в последний день месяца, кроме 31 декабря. Другой вариант — налоговый год продолжительностью от 52 до 53 недель. Это финансовый налоговый год, продолжительность которого составляет от 52 до 53 недель, но он не обязательно должен заканчиваться в последний день месяца.
Вам может понадобиться EIN
EIN — это идентификационный номер работодателя.Хотя это требуется только в том случае, если ваш бизнес объединяется, работает как партнерство или имеет сотрудников, это хорошая идея для любого бизнеса. Вы будете часто предоставлять свой идентификационный номер налогоплательщика подрядчикам и поставщикам, и лучше иметь EIN, чем указывать свой личный номер социального страхования! EIN очень легко запросить на веб-сайте IRS.
Вы всегда должны проконсультироваться с налоговым специалистом или юристом перед тем, как зарегистрировать или изменить структуру вашего бизнеса, и не забывайте, что вы всегда можете изменить способ организации вашего бизнеса на своем пути.Мы рекомендуем работать с сертифицированным налоговым профи Block Advisors для малого бизнеса, потому что они могут помочь вам с налогами на малый бизнес и многим другим — для малых предприятий, подобных вашему.
Мнения, выраженные в этом комментарии, принадлежат автору и не обязательно отражают мнения Kestra Investment Services, LLC или Kestra Advisory Services, LLC. Это только для общей информации и не предназначено для предоставления конкретных инвестиционных советов или рекомендаций для какого-либо лица.Рекомендуется проконсультироваться со своим финансовым специалистом, юристом или налоговым консультантом в отношении вашей индивидуальной ситуации. Комментарии относительно прошлых результатов не предназначены для прогнозирования и не должны рассматриваться как указание на будущие результаты. Ценные бумаги, предлагаемые через Kestra Investment Services, LLC (Kestra IS), член FINRA / SIPC. Консультационные услуги по инвестициям, предлагаемые через Kestra Advisory Services, LLC (Kestra AS), дочернюю компанию Kestra IS. Финансовые партнеры O’Keeffe и любые другие организации, перечисленные здесь, не связаны с Kestra IS или Kestra AS Investor Disclosures: https: // bit.ly / KF-Disclosures
Ознакомьтесь с более полезными материалами о деньгах от Selfmade Finance School:
5 терминов, которые необходимо знать, которые могут спасти вас в этом налоговом сезоне
Действительно ли мне нужен бухгалтер для налогового сезона
4 совета по преодолению пандемии на уровне профессионалов малого бизнеса
Анализ основного комплекса гистосовместимости косички-макаки Молекулы класса I, представляющие иммунодоминантные эпитопы вируса обезьяньего иммунодефицита
РЕЗЮМЕ
Успешные вакцины против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) должны вызывать эффективный Т-клеточный иммунитет.Мы изучали иммунодоминантные Gag-специфические Т-клеточные ответы вируса обезьяньего иммунодефицита (SIV) и их ограничивающие аллели класса I главного комплекса гистосовместимости (MHC) у макак с косичками ( Macaca nemestrina ), все более распространенной модели приматов для изучения ВИЧ-инфекции. люди. CD8 + Т-клеточные ответы на эпитоп SIV, Gag 164 — 172 KP9, присутствовали по крайней мере у 15 из 36 беспородных косичков. Иммунодоминантный KP9-специфический ответ составлял большую часть (в среднем 63%) Gag-ответа SIV.Секвенирование от шести макак выявило 7 новых аллелей Mane-A и 13 новых Mane-B MHC класса I. Один новый аллель, Mane-A * 10 , был общим для четырех макак, ответивших на эпитоп KP9. Мы адаптировали опосредованный эталонной цепью конформационный анализ (RSCA) к MHC class I генотип M. nemestrina. Mane-A * 10 был обнаружен у макак, представляющих KP9, изученных RSCA, но отсутствовал у макак, не представляющих KP9. Экспрессированные на клетках с дефицитом класса I, Mane-A * 10, но не другие молекулы MHC класса I макаки с косичками, эффективно презентовали KP9 отвечающим Т-клеткам, подтверждая, что Mane-A * 10 ограничивает эпитоп KP9.Важно отметить, что наивные макаки с косичками, инфицированные SIV mac251 , которые реагируют на KP9, имели значительно сниженные уровни вируса SIV в плазме (log 10 0,87 копий / мл; P = 0,025) по сравнению с таковыми у макак, не отвечающих на KP9. Идентификация этого распространенного аллеля M. nemestrina MHC класса I, ограничивающего функционально важный иммунодоминантный эпитоп Gag SIV, создает основу для изучения Т-клеточного ответа CD8 + против СПИДа у важных, широко доступных видов приматов.
Актуальная задача разработки эффективной вакцины против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) требует понимания иммунопатогенеза ВИЧ. CD8 + Т-клеточные ответы играют жизненно важную роль в контроле естественной ВИЧ-инфекции (35, 42, 45), и большая часть разработки вакцин сосредоточена на индукции этих ответов (6, 12, 41, 58). Детальный анализ CD8 + Т-клеточных ответов требует знания об ограничении молекул класса I главного комплекса гистосовместимости (MHC), которые представляют вирусные эпитопы, и определения специфичности и широты иммунного ответа.
В моделях ВИЧ-инфекции человека и макак ограниченное количество определенных вирусных эпитопов вызывает Т-клеточные ответы CD8 + у любого индивидуума (26, 44, 61, 63). Исследование наиболее сильных иммунодоминантных Т-клеточных ответов способствует более детальному пониманию иммунного контроля над инфекцией, определяя стратегии эффективной вакцинации (2, 9, 60). Сильные ответы на иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы сами по себе могут привести к защитному иммунитету при некоторых модельных вирусных инфекциях (33).И наоборот, ответы Т-клеток часто позволяют отобрать штаммы ВИЧ с мутациями, ускользающими от контроля Т-клеток. Кроме того, мутации в Т-клеточных эпитопах могут привести к СПИДу, и вполне вероятно, что защитная вакцина против ВИЧ должна будет вызывать широко направленные ответы против как доминантных, так и субдоминантных Т-клеточных эпитопов (4, 11, 13, 17, 25, 28 , 48).
Обезьяний вирус иммунодефицита (SIV) или химерный вирус SIV / HIV (SHIV) азиатских макак, особенно макак-резусов ( Macaca mulatta ), яванских макак ( M.fascicularis ) и макаки с косичками ( M. nemestrina ) являются наиболее распространенными и хорошо охарактеризованными моделями животных, используемыми в исследованиях ВИЧ. Описание аллеля MHC класса I макаки-резуса, Mamu-A * 01 (43), и определение его пептид-связывающего мотива (5) позволило детально изучить специфические ответы Т-клеток CD8 + у этого вида. К сожалению, в настоящее время существует очень ограниченное количество макак с положительным диагнозом Mamu-A * 01 (19, 46).
Многие группы в настоящее время используют макак с косичками в качестве альтернативной и надежной модели для исследований вакцины против ВИЧ (18, 22, 27) и патогенеза (15, 16, 52, 57).К сожалению, полезность этой модели на сегодняшний день ограничена отсутствием детального понимания Т-клеточного иммунитета и генетики MHC. Определение иммунодоминантных вирусных эпитопов и их ограничивающих аллелей MHC класса I в моделях на животных, таких как макаки с косичками, является важной и неотложной задачей для подтверждения результатов в модели резус и расширения ресурсов, доступных исследователям ВИЧ.
Аллели MHC класса I еще не были полностью охарактеризованы у макак с косичками.Было секвенировано ограниченное количество M. nemestrina ( Mane ) аллелей MHC класса I (38), хотя ответы Т-клеток, ограниченные этими аллелями, не были идентифицированы. В этом исследовании мы описываем идентификацию общего иммунодоминантного ответа на KP9, 9-мерный эпитоп Gag у вакцинированных макак с косичками, а также характеристику его ограничивающей молекулы MHC класса I, Mane-A * 10. Кроме того, исследование наивных макак с косичками, инфицированных SIV mac251 , демонстрирует, что респондеры KP9 имеют значительно сниженную вирусную нагрузку по сравнению с таковой у не ответивших на KP9.Здесь мы описываем использование нескольких экспериментальных стратегий, включая обычную стратегию клонирования и секвенирования, новую адаптацию конформационного анализа, опосредованного эталонной цепью (RSCA), метод, основанный на флуоресценции, и функциональный анализ для установления того, что Mane-A * 10 связывает общий и значимый иммунодоминантный CD8 + Т-клеточный эпитоп KP9.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования вакцины / заражения макак и Gag для вируса SIV. Чтобы создать и составить карту эпитопа CD8 + Т-клеточных ответов на Gag SIV и затем определить их ограничение MHC, мы исследовали макак с косичками ( M.nemestrina ), участвовавших в исследованиях вакцины Gag от вируса SIV и заражения вирусом SHIV. Макаки были иммунизированы внутримышечно комбинациями схем первичной / буст-вакцинации ДНК и поксвируса птиц, экспрессирующих SIV mac239 Gag, в качестве модификации ранее описанных методов (32). Макак заражали либо SHIV mn229 (21), либо SHIV sf162P3 (29). В первые несколько недель после заражения вирусом было обнаружено значительное увеличение циркулирующих Gag-специфических SIV Т-клеток CD8 + (20), как описано ранее для аналогичных экспериментов с вакциной / заражением SHIV макак (6, 9, 58).Чтобы оценить влияние Т-клеточных ответов на SIV Gag 16 4 — 1 72 KP9, восемь наивных макак были инфицированы внутривенно SIV mac251 (53). Исходный материал SIV mac251 , ранее вводимый интраректально (31), разводили 1: 200 в среде RPMI и вводили в дозе 1 мл. Презентацию KP9 после инфицирования выясняли путем окрашивания внутриклеточных цитокинов (описано ниже). Уровни РНК SIV в плазме и периферических CD4 + Т-клеток оценивали, как описано ранее (20, 21).Макаки содержались в условиях физического уровня сдерживания 3 (PC3) и анестезировали кетамином (10 мг / кг веса тела, вводимого внутримышечно) перед забором крови с использованием антикоагулянтов гепарина или ЭДТА. Комитеты по этике животных Мельбурнского университета и Организации научных промышленных исследований Содружества (CSIRO) одобрили все эксперименты.
Картирование эпитопов с помощью IFN-γ ELISpot и окрашивания внутриклеточных цитокинов. Ответы на антиген-специфический гамма-интерферон (IFN-γ) измеряли в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) или цельной крови с помощью ELISpot и анализа внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS), соответственно .Набор ELISpot IFN-γ обезьяны (U-CyTech, Утрехт, Нидерланды) использовали, как описано ранее (21). Вкратце, PBMC стимулировали пулом из 125 перекрывающихся 15-мерных пептидов SIV mac239 Gag, индивидуальных 15-мерных пептидов (любезно предоставленных Национальным институтом здравоохранения по исследованию СПИДа и Программой эталонных реагентов) или минимум 9-11- мерные пептиды (Chiron Mimotopes, Clayton, Австралия) в концентрации 1 мкг / мл в течение 18 часов, промывали и переносили на планшеты, покрытые моноклональными антителами против IFN-γ, и инкубировали в течение 5 часов (37 ° C, 5% CO 2 ).Клетки лизировали, и лунки инкубировали с биотинилированным поликлональным кроличьим антителом против IFN-γ с последующей инкубацией с меченным золотом антителом к иммуноглобулину G (IgG) против биотина. Пятна IFN-γ были проявлены и подсчитаны на автоматическом считывающем устройстве (AID, Strassberg, Германия), и результаты были нормализованы к частоте антиген-специфичных предшественников, секретирующих IFN-γ, на 10 6 PBMC. Пороговые значения для положительных ответов были основаны на статистически определенных порогах для анализа ELISpot, утвержденных для клинических испытаний (54).Это определило положительный ответ как соответствующий следующим критериям: (i) ≥50 пятнообразующих клеток / 10 6 PBMC после вычитания количества пятен в отрицательных контролях и (ii) неспецифический фон менее половины антиген-специфического количества.
Внутриклеточную секрецию IFN-γ оценивали с помощью проточной цитометрии, как описано ранее (21, 40). Короче говоря, 200 мкл цельной крови инкубировали с пептидами, как описано выше, в концентрации 1 мкг / мл вместе с костимулирующими антителами против CD28 (клон L293) и анти-CD49d (клон L25.3) (BD Biosciences, Фарминген, Сан-Диего, Калифорния) в течение 2 ч при 37 ° C, 5% CO 2 . Затем добавляли брефельдин А (10 мкг / мл; Sigma, Сент-Луис, Миссури), и кровь инкубировали еще 4-5 часов. Затем клетки окрашивали изотиоцианатом анти-CD4-флуоресцеина (клон M-T477), анти-CD3-фикоэритрином (клон SP34) и анти-CD8-PerCP (клон SK1) (BD Biosciences) в течение 30 мин при 4 ° C. . Затем эритроциты лизировали с использованием лизирующего раствора (BD) сортировщика клеток с активацией флуоресценции (FACS) и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), а оставшиеся клетки подвергали проницаемости с помощью раствора, обеспечивающего проницаемость FACS (BD).Затем клетки инкубировали с анти-IFN-γ-аллофикоцианином (APC; клон B27; BD) и фиксировали формальдегидом перед сбором (BD FACScalibur). Антиген-специфические ответы Т-клеток CD8 + оценивали как процент клеток CD3 + CD8 + , экспрессирующих IFN-γ, по сравнению с культурами, стимулированными контролем. Пороговое значение для положительных ответов было определено как 0,1% от всех CD8 + Т-клеток при условии, что это значение было по крайней мере в три раза больше, чем фоновая продукция IFN-γ, наблюдаемая в клетках, стимулированных диметилсульфоксидом (ДМСО).
Амплификация и клонирование MHC. КДНК первой цепи была создана из общей РНК (экстрагированной с использованием набора QIAamp RNA Blood Mini; QIAGEN, Hilden, Germany) в реакционной смеси, содержащей олиго (dT) 12 — 18 (Invitrogen, Carlsbad, CA), по 2,5 мМ дезоксинуклеозидтрифосфат (Promega, Madison, WI), дитиотреитол (Invitrogen), RNasin (Promega), 5-кратный буфер первой цепи и SuperScript III RNase H — обратная транскриптаза. (Invitrogen). Условия реакции: 65 ° C в течение 5 минут, 42 ° C в течение 2 минут (пауза), 42 ° C в течение 50 минут и 70 ° C в течение 15 минут с использованием термоциклера для ПЦР GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния).
Полноразмерный M. nemestrina MHC класса I амплифицировали с использованием 25 мкМ каждого набора праймеров 5’ALoci (5′-TCACACTTTACAAGCCGTGAGAGACAC-3 ‘) и 3’ALoci (5′-ATGGCGCCCCGAACCCTC-3′) (локусы A) или 5’BLoci (5’-TCATGGCGCCCCGAACCCTC-3 ‘) и 3’BLoci (5′-TCAAGCCGTGAGAGACWCATCAGAGCC-3’) (локусы B), сконструированные на основе последовательностей MHC класса I макака-резуса (47). Ампликоны получали с использованием ДНК-полимеразы Platinum Pfx (Invitrogen) в течение 20 циклов (94 ° C в течение 1 минуты, 65 ° C в течение 1 с, 69 ° C в течение 90 секунд). Усиленный MHC класса I 1.КДНК размером 1 т.п.н. очищали из 1% агарозного геля с использованием набора для экстракции геля QIAquick (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя. Затем индивидуальные ампликоны MHC класса I лигировали в вектор pCR (Invitrogen) и трансформировали в компетентную Escherichia coli . Экстракты ДНК Miniprep (QIAGEN QIAprep) получали из 48 колоний трансформантов каждого из локусов A и B. Обе нити каждого клона секвенировали с использованием химии BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems), а затем анализировали на капиллярном секвенаторе (3730 DNA Analyzer; Applied Biosystems).Амплификацию от одной из шести секвенированных макак (4247) проводили с использованием модифицированного метода с 20 пмоль каждого 5’RSCA (5′-GCTACGTGGAYGAYACGC-3 ‘) и 3’RSCA (5′-CARAAGGCACMWCCACAGC-3’) праймеров (J Weinfurter et al., Неопубликованные данные), используя Amplitaq Gold (Applied Biosystems) в течение 35 циклов (начальный цикл 95 ° C в течение 10 минут, затем 94 ° C в течение 30 секунд, 57 ° C в течение 1 минуты, 72 ° C в течение 1 мин), генерируя фрагмент размером ∼700 п.н. Последовательности анализировали с использованием программного обеспечения Sequencher (Gene Codes Corporation, Анн-Арбор, Мичиган).Идентичная последовательность с смежными прямой и обратной последовательностями из трех или более клонов считалась вероятной истинными аллелями MHC класса I.
RSCA. Метод RSCA для характеристики M. nemestrina молекул MHC был адаптирован из аналогичных методов для обнаружения аллелей MHC у макака-резуса (Weinfurter et al., Неопубликовано) и человека (7). Приблизительно 700 п.н. кДНК MHC класса I, охватывающую экзоны два и три (кодирующие пептид-связывающие области), амплифицировали из кДНК пигтейла макака с использованием праймеров 5’RSCA и 3’RSCA, как описано выше, в течение 35 циклов с Taq Hi ДНК-полимераза Fi (Invitrogen).Контрольные цепи Mamu-B * 07 и Mamu-B * 60 амплифицировали с помощью ПЦР в тех же условиях, за исключением того, что 5’RSCA был заменен на Cy5-5’RSCA, меченный 5′-концом. Реакции RSCA для образования гетеродуплексов между референсными цепями и аллелями амплифицированной кДНК с неизвестными аллелями MHC проводили следующим образом: 95 ° C в течение 4 минут, 55 ° C в течение 5 минут, 15 ° C в течение 5 минут. Затем продукт прогоняли в неденатурирующем полиакриламидном геле в течение 7 часов вместе со стандартами внешнего размера на анализаторе ДНК AlfExpress (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) в соответствии с инструкциями производителя. Скорость миграции аллеля в геле определялась конформацией аллеля с конкретной эталонной цепью. Идентичные аллели, общие для макак, обладают одинаковой подвижностью при гетеродуплексе с одной и той же эталонной цепью. Иногда конформационный гетеродуплекс различных аллелей будет иметь идентичную подвижность, поэтому каждый образец кДНК гибридизуют отдельно с несколькими эталонными цепями для проверки результатов RSCA.
Создание слитых конструкций MHC класса I / GFP.Полноразмерные ампликоны MHC класса I получали из кДНК 4247 макака с использованием праймеров ManeMHCF (5′-RWKSYGDTCRTGGCGCYC-3 ‘) и ManeMHCR (5′-GAKCCRTGAGAGACACATC-3’), а затем лигировали в pc-DNA3.1- Вектор GFP-TOPO (Invitrogen), создающий C-концевой продукт слияния. Плазмиды слияния MHC / зеленый флуоресцентный белок (GFP) трансформировали в TOP10 E. coli , и ДНК экстрагировали с использованием набора FastPlasmid Mini (Eppendorf, Гамбург, Германия). Трансформанты подвергали скринингу на предмет правильной ориентации вставки путем секвенирования с 3′-конца с использованием обратного праймера GFP (5′-GGGTAAGCTTTCCGTATGTAGC-3 ‘) и химии циклического секвенирования DYEnamic ET Terminator (Amersham), выполняемой на генетическом анализаторе ABI 3100 (Applied Biosystems).Затем вставки в правильной ориентации полностью секвенировали с 5′-конца с использованием праймера Т7 (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ‘).
Стабильная трансфекция в клетки C1R. Линия B-лимфобластоидных клеток человека с дефицитом MHC класса I, C1R (64), поддерживалась в среде RPMI 1640 (Invitrogen) с добавлением 100 Ед пенициллина G натрия / мл, 100 мкг стрептомицина сульфата / мл, 292 мкг l-глутамина (PSG) (Invitrogen) / мл и 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (CSL, Lenexa, Kans.) (RF-10). Для стабильной трансфекции в клетки C1R были отобраны пять конструкций MHC / GFP: Mane-A * 10 (C1R-A * 10), Mane-B * 02 (C1R-B * 02), еще одна A-подобная конструкция, 4247-09 / G (C1R-09 / G), еще одна B-подобная конструкция, 4247-02 / G (C1R-02 / G), и контрольная конструкция со вставкой в обратной ориентации, 4247-11 / G (C1R- 11 / G).Трансфицированная конструкция Mane-A * 10 непреднамеренно содержала мутацию A-to-G в положении нуклеотида 656, соответствующую замене E-to-G в положении 198 аминокислоты. Находясь внутри домена α3, эта замена вряд ли повлияет на пептид-связывающая специфичность молекулы и, как полагают, возникла в результате случайной ошибки ПЦР. Десять микрограммов стерильной плазмиды электропорировали при 220 В, 950 мкФ в 10 7 клеток C1R с использованием Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Ричмонд, Калифорния.) с расширителем емкости (Bio-Rad). Клетки культивировали в RF-10 в течение 48 часов и отбирали в RF-10 плюс 1 мг Генетицина (Invitrogen) / мл и 2 мМ HEPES в 96-луночных планшетах с U-образным дном (Nunc, Roskilde, Дания). Среду меняли каждые 3-4 дня в течение 3 недель, и лунки, содержащие растущие клетки, подвергали скринингу на экспрессию GFP и MHC класса I с использованием первичных антител пан-класса I W6 / 32 (8, 51), вторичных овечьих анти- антитела к мышиному Ig-фикоэритрину (Chemicon) и проточная цитометрия (BD FACScalibur).
Получение KP9-специфичных линий Т-клеток. Замороженные PBMC быстро размораживали от макак 4247 и 4296 и дважды промывали RPMI. PBMC (5 × 10 6 ) были обозначены как клетки-стимуляторы, а 10 7 PBMC были обозначены как отвечающие клетки (соотношение респондера к стимулятору 2: 1). Клетки-респонденты ресуспендировали в 1 мл RF-15 с добавлением 50 ед. Человеческого интерлейкина-2 (IL-2) (Sigma) / мл и 10 нг человеческого IL-7 (Sigma) / мл и помещали в 24-кратный планшет с лунками (TPP, Trasadingen, Switzerland) при 37 ° C, 5% CO 2 .Клетки-стимуляторы ресуспендировали в 1 мл RPMI плюс 1 мкг пептида KP9 / мл и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин, а затем промывали в RPMI. Затем клетки-стимуляторы облучали с использованием источника 60 Co при 3000 рад, снова промывали RPMI, ресуспендировали в 1 мл RF-15 плюс IL-2 и IL-7 и добавляли к отвечающим клеткам. Клетки разделяли каждые 3-4 дня и кормили свежим RF-15 плюс 50 ЕД IL-2 / мл, если необходимо. Клетки рестимулировали фидерными клетками PBMC, облученными импульсным пептидом, на 10-12 и 23 дни и анализировали либо на 17, либо на 27 день.
Ограничение МНС KP9-специфических Т-клеток. Модифицированный анализ внутриклеточного окрашивания IFN-γ использовали для оценки презентации антигена трансфецированными клонами C1R. Всего 2 × 10 5 увеличившихся Т-клеток (респондеров) промывали в RPMI, ресуспендировали в 100 мкл раствора, содержащего RPMI / PSG плюс 5% FCS (RF-5), добавляли в лунки 96-луночного U-образного дна. -луночный планшет (Nunc), помещенный при 37 ° C. Объем 10 5 C1R-A * 10, C1R-B * 02, C1R-02 / G, C1R-09 / G и C1R-11 / G (стимуляторы) дважды промывали в RPMI.Затем клетки-стимуляторы ресуспендировали в 500 мкл RPMI и обрабатывали 1 мкг пептида KP9 / мл в течение 30 мин при 37 ° C. Затем клетки дважды промывали RPMI, ресуспендировали в 100 мкл RF-5 и добавляли к отвечающим клеткам в 96-луночном планшете (соотношение респондера и стимулятора 2: 1). Смешанные клетки инкубировали при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 2 часов, а затем добавляли 10 мкг брефельдина A (Sigma) / мл. Затем последовала дополнительная 4-часовая инкубация, а затем клетки были окрашены анти-CD4-флуоресцеинизотиоцианатом, анти-CD3-фикоэритрином и анти-CD8-PerCP (BD) в течение 30 минут при 4 ° C.Клетки промывали, фиксировали в 1% параформальдегиде в течение 20 мин, а затем снова промывали. Затем к клеткам добавляли комбинацию 0,3% сапонина и анти-IFN-γ-APC (BD) на 40 мин при 4 ° C. Клетки промывали один раз и переносили в 5-мл полистирольные пробирки для FACS для сбора (BD FACScalibur) и анализа с использованием CellQuest Pro (BD).
Номера доступа нуклеотидных последовательностей. Последовательности 20 новых аллелей MHC класса I, определенные в этом исследовании, депонированы в базе данных GenBank под номерами доступа AY557348. кому: AY557367 .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Иммунодоминантные эпитопы Gag SIV у макак с косичками. Никакие предыдущие исследования не описывали эпитопы Т-клеток CD8 + или ограничение этих ответов МНС у макак с косичками, все более широко распространенной животной моделью ВИЧ. В этом исследовании мы первоначально охарактеризовали общепризнанные эпитопы Gag SIV в большой когорте макак с косичками. Т-клеточные ответы на SIV Gag были подробно проанализированы с помощью IFN-γ ELISpot и ICS на 36 косичках, включенных в испытания вакцины против SHIV, включающие иммунизацию различными комбинациями ДНК и вакцин против вируса оспы птиц и контрольное заражение либо SHIV mn229 , либо SHIV sf162P3. (20, 21, 29).Сильные SIV Gag CD8 + Т-клеточные ответы, включающие от 0,6 до 34,7% всех Т-клеток CD8 + , были обнаружены после заражения у 23 из 36 макак (63,9%) с использованием пептидного пула, содержащего 125 перекрывающихся 15-мерных пептидов. на 11 аминокислот, охватывающих всю область Gag SIV. Эти ответы были картированы с использованием 5- или 10-пептидных пулов, за которыми следовали отдельные 15-мерные пептиды. Ответ на 15-мерный Gag 161 — 175 пептид 41 был обнаружен у 15 из 23 макак, отвечающих на Gag, что составляет 41.7% всех макак и 65,2% респондентов Gag (Таблица 1). Не было обнаружено ответов на непосредственно соседние перекрывающиеся пептиды 40 или 42, что позволяет предположить, что минимальный эпитоп, вероятно, был 9-мерным, охватывающим центр пептида 41. В среднем, ответ Т-клеток CD8 + на пептид 41 учитывался для 63% ответа на Gag (фиг. 1A и B; таблица 1), хотя это может быть несколько завышенным, учитывая, что у некоторых макак реакция пептида 41 превышала ответ общего пула Gag.Более высокий ответ на пептид 41 по сравнению с ответом на Gag у этих животных предполагает возможную конкуренцию за связывание MHC с другими пептидами в пуле. Кинетика Т-клеточного ответа CD8 + , специфичного для пептида 41, соответствовала общему Gag-ответу SIV после заражения SHIV (фиг. 1B).
РИС. 1.Картирование минимального иммунодоминантного эпитопа Gag SIV в пептиде 41. (A) Цельная кровь от Gag-иммунизированного SIV макака 4668 через 3 недели после заражения SHIV mn229 стимулировалась либо пулом из 125 SIV Gag 15-меров, либо только 41-й пептид в этом пуле.CD3 + Т-лимфоциты исследовали на процентное содержание CD8 + Т-клеток, экспрессирующих IFN-γ с помощью ICS. (B) Ответы на SIV Gag и пептид 41 от макака 4246 отслеживали в течение 8 недель после заражения SHIV. (C) Минимальный эпитоп в 15-мерном пептиде 41 SIV Gag был картирован путем создания линии Т-клеток от животного 4296 и изучения реактивности Т-клеток к центральным 10-, 9- и 8-мерным пептидам в пептиде 41 и не перекрывается с 15-мерными пептидами 40 и 42 (см. Таблицу 1).
ТАБЛИЦА 1.Иммунодоминантность пептида Gag 41 SIV
Минимальный эпитоп, содержащийся в 15-мере пептида 41, определяли путем внутриклеточного окрашивания IFN-γ с использованием антиген-специфических Т-клеток и титрования пептидов 8-, 9- и 10-меры происходят из центральной области пептида 41 (фиг. 1C). Это титрование четко продемонстрировало превосходную реактивность Т-клеток по отношению к 9-мерному KP9 по сравнению с реактивностью других соседних 8-мерных и 10-мерных пептидов. Эти результаты титрования, определяющие KP9 как минимальный эпитоп, были подтверждены анализом ELISpot на свежих образцах PBMC, причем KP9 был единственным пептидом, все еще стимулирующим ответ при 10 нг / мл (данные не показаны).
В дополнение к ответу, обнаруженному на KP9 в пептиде 41, были обнаружены ответы субдоминантов CD8 + Т-клеток у более чем одного макака с косичками на пептид 7 (GKKKYMLKHVVWAAN), пептид 62 (EQIQWMYRQQNPIPV) и пептид 63 (WMN . Аналогичный процесс определения минимального эпитопа с использованием усеченных пептидов в анализах ELISpot и ICS был выполнен с ответом пептида 7, картированным с 9-мерным KW9 (KYMLKHVVW) (фиг. 2A), и ответом пептида 62/63, картированным к 8-мерному YP8 (YRQQNPIP) (рис.2Б).
РИС. 2.Минимальное картирование эпитопа дополнительных ответов Gag. (A) Ответ на пептид 7 был сопоставлен с минимальным 9-мерным KW9 с помощью ELISpot. Ответы на ДМСО и стафилококковый энтеротоксин В (SEB) показаны как отрицательный и положительный контроли соответственно. (B) Ответы на перекрывающиеся пептиды 62 и 63 были сопоставлены с 8-мерным YP8 с помощью ICS.
Секвенирование 20 новых аллелей MHC класса I макаки с косичками. Использование консервативных праймеров, разработанных для аллелей MHC класса I макаки-резус, позволило амплифицировать несколько последовательностей макака с косичками.Стратегия клонирования и секвенирования генерировала множественные последовательности от макак 4241, 4247, 4293, 4295, 4296 и 4664. Был принят консервативный подход для определения новых аллелей, требующих по крайней мере трех идентичных независимых смежных последовательностей. Используя этот подход, 20 новых аллелей MHC класса I были идентифицированы у макак с косичками, 7 аллелей Mane-A и 13 аллелей Mane-B (номера доступа GenBank AY557348 кому: AY557367 ). Выравнивание предсказанных аминокислотных последовательностей пептид-связывающих доменов этих аллелей показано на рис.3, с ранее опубликованными последовательностями Mane , предоставленными для сравнения. У каждой макаки было идентифицировано до двух аллелей Mane — A и четырех Mane — B , что согласуется с наблюдением, что у этого вида имело место дупликация локуса Mane-B (38), и аналогично наблюдениям с макаками-резусами и бабуинами (1, 14). Вероятно, что менее консервативный метод определения аллелей привел бы к обнаружению более двух аллелей Mane-A у одной макаки, поскольку ранее было показано, что этот локус дублируется в M.Неместрина (38). Удивительно, но из 18 аллелей MHC класса I макак, описанных ранее (38), только два были обнаружены в нашей когорте макак: Mane-B * 02 у макак 4247 и Mane-B * 05 у макак 4664.
ИНЖИР. 3.Аминокислотное выравнивание доменов α1 и α2 20 новых аллелей MHC класса I косички макака. До 96 клонов кДНК MHC класса I от шести макак с косичками подверглись прямому и обратному секвенированию, в результате чего были получены фрагменты размером от 700 до 1000 пар оснований. Аллели были определены там, где были обнаружены по крайней мере три идентичных клона с полной непрерывной последовательностью ( Mane-B * 22 был определен из-за его близкого родства с Mane-B * 11 и Mane-B * 12 , несмотря на то, что он только присутствует в двух клонах).Показаны предсказанные трансляции аминокислот в доменах α1 и α2, пептидсвязывающих областях. Лидерная, α3, трансмембранная и цитоплазматическая последовательности также были идентичны в пределах каждого определенного аллеля (данные не показаны; см. Номера доступа в GenBank AY557348). кому: AY557367 ). Близкородственные аллели заключены в рамку (см. Текст и таблицу 2). Аллели, выделенные жирным шрифтом, представляют собой недавно описанные аллели. Аллели, не выделенные жирным шрифтом, были описаны ранее (38) и представлены для сравнения. Мы подтвердили присутствие Mane-B * 02 и Mane-B * 05 у макак с косичками, изученных в этом отчете (отмечены надстрочной буквой b), с объединенными дополнительными клонами и количеством животных.
Вариация между вновь определенными аллелями происходит в отдельных областях пептид-связывающих (α1 и α2) доменов, особенно в областях, охватывающих остатки 9–25, 62–83 и 152–170. Эти изменения соответствуют расположению известных карманные остатки, которые важны для определения пептид-связывающей специфичности аллелей (55, 62). Некоторые из описанных новых аллельных последовательностей очень тесно связаны. Mane-A * 10 и Mane-A * 16 различаются в общей сложности на пять нуклеотидов, что дает всего два различия на уровне аминокислот (положения -9 и 97), одно из них в лидерной последовательности, которая является отщепляется от зрелой молекулы MHC класса I. Mane-A * 11 и Mane-A * 12 отличаются одним нуклеотидом, что приводит к замене аминокислоты в положении 309 по направлению к С-концу трансмембранной области. Mane-B * 11 , Mane-B * 12 и Mane-B * 22 все тесно связаны между собой, при этом Mane-B * 11 и Mane-B * 22 отличаются только одним нуклеотидом. (и на одну аминокислоту) в цитоплазматическом хвосте. Mane-B * 12 отличается от Mane-B * 11 и Mane-B * 22 двумя нуклеотидами, один из которых вызывает несинонимичную замену аминокислоты R на H в положении 70 в домене α1.
аллелей MHC класса I, общих у макак, представляющих эпитопы SIV. После секвенирования MHC класса I обнаруженные иммунные ответы на KP9, YP8 и KW9 коррелировали с наличием определенных аллелей для идентификации потенциальных ограничивающих аллелей для этих эпитопов (таблица 2) . Из шести макак, у которых были секвенированы аллели MHC класса I, пять ответили на KP9: 4241, 4247, 4295, 4296 и 4664. Аллель Mane-A * 10 был обнаружен у четырех из этих макак, и у близкородственных аллель Mane-A * 16 был обнаружен у слабого KP9-респондера 4241.Ни Mane-A * 10 , ни Mane-A * 16 не были обнаружены у не-KP9 ответчика 4293. Это убедительно свидетельствует о том, что молекула Mane-A * 10 участвует в презентации эпитопа KP9. Две макаки, 4295 и 4293, обе ответили на эпитоп Gag 251 — 258 YP8. Mane-A * 12 был обнаружен у макака 4295, а близкородственный аллель Mane-A * 11 (отличающийся только одним нуклеотидом) был обнаружен в 4293. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, один или оба из этих аллелей может представлять YP8.Макаки 4296 и 4293 оба ответили на эпитоп Gag 164 — 172 KW9. Эти две макаки разделяют экспрессию двух молекул, Mane-A * 14 и Mane-B * 10, которые потенциально могут связывать KW9. Кроме того, 4296 экспрессирует молекулу Mane-B * 22, а 4293 экспрессирует очень близкую молекулу Mane-B * 11. Третья молекула в родственном кластере, Mane-B * 12, экспрессируется 4241 и 4295, и у нее нет ответа на эпитоп KW9, обнаруженный у этих макак, поэтому маловероятно, что какой-либо из B * 11 / B * 12 / Кластер B * 22 связывает KW9.Два дополнительных аллеля являются общими для макак, хотя их экспрессия не коррелирует ни с одним из ответов Т-клеток Gag CD8 + , обнаруженных на сегодняшний день. Макаки 4241 и 4295 имеют общий аллель Mane-B * 13 , а 4296 и 4664 имеют общий аллель Mane-B * 18 . Дальнейшие исследования будут необходимы для определения эпитопов SIV, связанных с Mane-B * 13 и Mane-B * 18.
ТАБЛИЦА 2.Корреляция общих пептид-специфических Т-клеточных ответов с общими аллелями MHC класса I
RSCA макак, представляющих эпитоп SIV Gag KP9.Клонирование и секвенирование кДНК MHC класса I — сложный метод скрининга большого числа субъектов на множественные неизвестные транскрипты MHC класса I. Разработанный на людях и недавно адаптированный для макак-резусов, RSCA представляет собой высокочувствительный метод для характеристики множественных экспрессируемых кДНК MHC класса I в одном образце (7). Этот метод гибридизирует приблизительно 700 п.н. кДНК MHC класса I с флуоресцентно меченными эталонными клонами класса I. Различные экспрессированные молекулы кДНК MHC класса I из одного гетеродуплекса макака с флуоресцентно меченным клоном и работают с определенной подвижностью на неденатурирующих гелях.Гетеродуплексирование неизвестных кДНК MHC класса I против более чем одной флуоресцентной эталонной цепи характеризует уникальный образец подвижности для определенных транскриптов MHC класса I. В предыдущих исследованиях использовались аллогенные референсные аллели MHC класса I. Это не позволяет обнаруживать аллель MHC класса I, идентичный эталонной цепи, поскольку гомодуплекс между флуоресцентным и нефлуоресцентным аллелями скрыт гомодуплексами только между флуоресцентным аллелем. Об использовании ксеногенных эталонных цепей для решения этой проблемы ранее не сообщалось.
Для создания паттерна аллелей MHC класса I, общих для M. nemestrina , способных отвечать на эпитоп KP9 SIV Gag, мы гибридизировали кДНК MHC класса I от девяти макак, представляющих KP9, и трех макак, не способных презентовать KP9 с флуоресцентным . M. mulatta Mamu-B * 60 и Mamu-B * 07 и проанализировали подвижность аллелей на неденатурирующем геле. Чтобы идентифицировать подвижность Mane-A * 10 , вероятного аллеля, представляющего KP9, идентифицированного путем секвенирования, мы проанализировали подвижность отдельных клонов Mane-A * 10 от макак 4295 и 4664.
Этот метод RSCA успешно выявил до восьми отдельных аллелей MHC класса I от отдельной макаки (рис. 4). Восемь из девяти макак, способных отвечать на KP9, имели один аллель MHC класса I, который мигрировал с идентичной подвижностью при гетеродуплексе на Mamu-B * 60 . Эта подвижность была идентична клонам Mane-A * 10 от макак 4295 и 4664, гетеродуплексированных с Mamu-B * 60 . Другая макака, отвечающая на KP9 (4241), имела аллель с немного меньшей подвижностью, чем у других макак, отвечающих на KP9.Интересно, что одна макака (h30x), у которой мы не смогли обнаружить иммунный ответ на KP9 (несмотря на сильный CD8-опосредованный ответ на SIV Gag), имела аллель с подвижностью, идентичной таковой Mane-A * 10 . Чтобы решить эти проблемы, кДНК MHC этих макак была гетеродуплексирована с другим аллелем M. mulatta , Mamu-B * 07 . В этом случае аллель с миграцией, идентичный таковому для Mane-A * 10 , не был обнаружен в кДНК макака h30x. Это предполагает, что аллель MHC класса I из h30x с миграцией, аналогичной таковой для Mane-A * 10 при гетеродуплексе с Mamu-B * 60 , не является Mane-A * 10 , что соответствует отсутствию CD8 + Т-клеточный ответ на KP9.Когда кДНК MHC класса I от девяти респондеров KP9 были гетеродуплексированы с Mamu-B * 07 , восемь из девяти ответчиков KP9 имели аллель с подвижностью, идентичной таковой для Mane-A * 10 , с выбросом, макак 4241 , опять же имеющий аллель с немного меньшей подвижностью. Интересно, что макака 4241 экспрессирует Mane-A * 16 , аллель, который отличается от Mane-A * 10 всего одним нуклеотидом во фрагменте RSCA размером ~ 700 п.н. Мы и другие ранее наблюдали замечательную чувствительность метода RSCA, при котором одного нуклеотида обычно достаточно для изменения подвижности гетеродуплексных клонов (данные не показаны).
РИС. 4.Mane-A * 10 обычно экспрессируется в кДНК косичек, отвечающих на эпитоп KP9 посредством RSCA. КДНК MHC класса I от 12 макак с косичками и клонированные Mane-A * 10 были гетеродуплексированы с флуоресцентными резус-аллелями Mamu-B * 60 или Mamu-B * 07 , и их подвижность оценивалась в неденатурирующем геле. Количество минут, необходимое для истечения каждого аллеля Mane MHC класса I, показано на оси x . Из всех образцов кДНК MHC класса I каждый пик представляет собой один аллель MHC класса I.Аллели, объединенные с клоном Mane-A * 10 , помещены в рамку. Иногда разные аллели могут иметь такую же подвижность, что и одна эталонная цепь (например, животное h30x; см. Текст). Однако это можно решить, используя несколько отдельных эталонных цепей. В нижнем разделе показаны репрезентативные образцы, гетеродуплексированные с маркировкой Mamu-B * 07 .
Mane-A * 10 связывает эпитоп KP9. Чтобы окончательно идентифицировать молекулу MHC класса I пигтейла макака, наиболее часто представляющую иммунодоминантный эпитоп KP9, мы выборочно трансфицировали линию клеток человека полноразмерным M.nemestrina клонов кДНК MHC класса I. Пять кДНК MHC класса I, полученных из макака 4247 (ответчик KP9), были клонированы в вектор, экспрессирующий GFP, и были стабильно трансфицированы в клеточную линию C1R, дефицитную по MHC класса I (64). Флуоресцентная микроскопия трансфицированных клеток продемонстрировала поверхностно-ассоциированный паттерн экспрессии GFP, предполагая, что трансфицированные кДНК MHC класса I были правильно обработаны и транспортированы на поверхность клетки (данные не показаны). Клетки, трансфицированные MHC класса I, экспрессирующие GFP, продемонстрировали повышенный уровень экспрессии поверхностного MHC класса I, в то время как клетки, трансфицированные контрольной конструкцией (11 / G), не показали такого увеличения (рис.5А).
РИС. 5.Mane-A * 10 связывает эпитоп KP9. (A) Mane-A * 10, Mane-B * 02 и обратно ориентированный контрольный клон MHC класса I (11 / G) от животного 4247 клонировали в вектор, экспрессирующий GFP, и стабильные трансфектанты были созданы в клетках C1R. Экспрессия MHC класса I и GFP была охарактеризована проточной цитометрией. Гистограммы показывают большинство трансфектантов Mane-A * 10 или Mane-B * 02, экспрессирующих высокий уровень MHC класса I (залитый серым графиком) по сравнению с таковым для трансфицированных контрольными клетками (единственная линия).Точечные диаграммы показывают, что в клетках, трансфицированных MHC класса I (C1R-A * 10), повышенная экспрессия MHC класса I связана с флуоресценцией GFP по сравнению с флуоресценцией клеток, трансфицированных контролем (C1R-11 / G). (B) KP9-специфическая Т-клеточная линия была получена от животного 4296 и была смешана с клетками C1R, экспрессирующими либо Mane-A * 10, либо Mane-B * 02, не иммунизированные пептидом (-KP9) или нагруженные эпитопом KP9 (+ КП9) на 6 ч. Высокоспецифическая стимуляция экспрессии IFN-γ в Т-клетках CD8 + была обнаружена с помощью проточной цитометрии, когда Mane-A * 10 представил KP9.
PBMC от макак 4296 и 4247 были увеличены до KP9-специфических Т-клеточных линий в течение 3 недель и были использованы в модифицированном анализе внутриклеточного окрашивания IFN-γ для оценки ограничения MHC класса I ответа KP9. В двух отдельных экспериментах результаты ясно продемонстрировали, что C1R-A * 10 в импульсном режиме с KP9 был способен стимулировать значительный KP9-специфический CD8 + Т-клеточный IFN-γ ответ в линии Т-клеток 4296 (фиг. 5B). Никакой специфической продукции IFN-γ не наблюдалось, когда клетки C1R-A * 10 не подвергались импульсной обработке пептидом KP9 или когда трансфектант C1R-B * 02 подвергался импульсной обработке пептидом KP9.Аналогичные результаты были получены с линией Т-клеток 4247 (данные не показаны). Кроме того, не наблюдалось никакой пептид-специфической продукции IFN-γ ни в 4247, ни в 4296 T-клеточной линии, подвергнутой воздействию клонов C1R с импульсным воздействием KP9, трансфицированных двумя другими аллелями MHC или контрольным аллелем в обратной ориентации (данные не показаны).
KP9-отвечающие макаки имеют более низкую вирусную нагрузку после заражения SIV mac251 . Чтобы оценить, повлияли ли ответы на эпитоп KP9 на течение инфекции SIV, восемь наивных макак (три ответчика KP9 и пять неответчиков) были инфицированы SIV. mac251 и оценивали во время острой инфекции на вирусную нагрузку SIV в плазме и уровни периферических CD4 + Т-клеток.В течение первых 7 недель инфекции сравнение вирусной нагрузки SIV в плазме и анализ с помощью теста суммы рангов Вилкоксона продемонстрировали, что респонденты KP9 имели значительно более низкую вирусную нагрузку (log 10 5,57 копий / мл), чем не ответившие KP9 (log 10). 6,44 копий / мл; P = 0,025) (рис. 6А). Аналогичный анализ периферических Т-лимфоцитов CD4 + не продемонстрировал каких-либо существенных различий между ответчиками KP9 и неответчиками (рис. 6В). Хотя анализ был проведен рано (до 7 недели после заражения), животные, представляющие KP9, были среди животных с наибольшим удержанием CD4 + Т-клеток, и значимые различия, вероятно, не проявятся до более позднего заражения.
РИС. 6.Презентация KP9 приводит к значительно более низкой вирусной нагрузке после заражения SIV у невакцинированных макак. (A) Вирусные нагрузки РНК SIV в плазме рассчитывались серийно в течение 7 недель после острой инфекции SIV mac251 . Открытые формы изображают не отвечающих на KP9 макак, а закрытые формы обозначают респондентов KP9. Разница в вирусной нагрузке между ответчиками KP9 и неответчиками KP9 (log 10 0,87) статистически значима ( P = 0,025). (B) Подсчет периферических лимфоцитов CD4 + наблюдался за тот же период острой инфекции SIV и отображается здесь как процент изменения во времени.Различия между ответчиками KP9 и неответчиками не являются значимыми до 7 недели после инфицирования ( P > 0,05).
ОБСУЖДЕНИЕ
В этом отчете описывается очень распространенный иммунодоминантный эпитоп Gag SIV, KP9, у вакцинированных макак с косичками и его ограничивающий аллель MHC класса I, Mane-A * 10 . Мы также описываем два субдоминантных эпитопа и их вероятные ограничивающие аллели MHC класса I. Новый метод RSCA для определения общих аллелей MHC класса I с использованием ксеногенных эталонных цепей макака-резуса облегчил этот анализ.Девятнадцать дополнительных новых A- и B- , подобных аллелям MHC класса I, и два дополнительных общих Т-клеточных эпитопа CD8 + также описаны для M. nemestrina . Мы также показываем, что презентация KP9 оказывает благотворное влияние на острые уровни вируса SIV. Эти эксперименты представляют собой первую корреляцию иммунодоминантных ответов SIV, ограничения класса I MHC и исхода инфекции SIV у макак с косичками. Это важный шаг вперед для растущего числа исследований с использованием макак с косичками в качестве модели на животных для ВИЧ-инфекции, что способствует разработке тетрамеров MHC класса I и исследованиям вакцин против SIV или SHIV с макаками с косичками, отобранными на предмет наличия Mane-A * 10.
Изучение иммунодоминантных Т-клеточных эпитопов дает важную информацию о характеристиках и динамике эффективных (и не очень эффективных) иммунных ответов. Было показано, что ответы Т-клеток CD8 + играют решающую роль в контроле как острой, так и хронической инфекции ВИЧ и SIV (30, 42, 49, 56). Идентификация доминантного эпитопа Gag SIV у косичек и его рестриктирующего аллеля позволяет более детально проанализировать роль этого Т-клеточного ответа CD8 + в контроле SIV, аналогично работе, проделанной с эпитопом Gag CM9 в Mamu- A * 01 -положительные макаки-резус (2, 3, 24, 37).Это значительно расширяет ресурсы, доступные для моделирования иммунопатогенеза ВИЧ и оценки вакцин-кандидатов.
Этот отчет дополняет единственный предыдущий отчет о секвенировании пигтейл-макаки MHC класса I (38). В этом исследовании презентация эпитопа не была связана с 19 аллелями гривы , секвенированными у пяти животных. Интересно, что несколько из ранее охарактеризованных M. nemestrina аллелей MHC класса I были обнаружены в когорте макак, изученных здесь, и аллель Mane-A * 10 , который, как мы обнаружили, экспрессируется у 8 из 11 макак, которые мы изучили с помощью секвенирование и RSCA ранее не были идентифицированы.Интересно, что KP9-специфические Т-клеточные ответы CD8 + были идентифицированы у 15 из 36 животных (41,7%), отвечающих на SIV Gag, что почти наверняка отражает чрезвычайно высокую частоту Mane-A * 10 или близкородственных аллелей. Мы обнаружили аллель Mane-A * 10 у макак с косичками как из австралийских, так и из индонезийских племенных колоний, а также из Вашингтонского университета (данные не показаны), что позволяет предположить, что Mane-A * 10 может быть обычным и широко распространен.Отсутствие обнаружения Mane-A * 10 у пяти макак с косичками, изученных в предыдущем отчете (38), могло отражать эффект основателя в колонии, из которой были получены пять макак, или могло быть связано с небольшим количеством животных, изученных в этом отчете, для которых использовались методы секвенирования с низкой пропускной способностью. Аминокислотная последовательность Gag в эпитопе KP9 является консервативной в большинстве штаммов SIV, полученных от макак, а также оказывается консервативной во многих штаммах ВИЧ-2 (36).
Для определения M.молекула nemestrina , ограничивающая эпитоп KP9: картирование эпитопа с использованием ELISpot и ICS, клонирование и секвенирование, трансфекция изолированных аллелей, анализы презентации антигена на линиях Т-клеток и новый метод ксеногенной RSCA. В то время как для первоначальной характеристики аллелей требовалась строгая, но низкопроизводительная стратегия клонирования и секвенирования, технология RSCA позволяла проводить чувствительный и быстрый скрининг аллелей MHC класса I у нескольких макак с косичками. Производительность потенциально может быть увеличена за счет использования жидкофазных капиллярных технологий, которые сейчас используются для высокопроизводительного секвенирования (23, 59).С помощью капиллярного секвенатора можно использовать несколько референсных аллелей, помеченных разными флуоресцентными красителями, что устраняет необходимость запускать несколько неденатурирующих гелей с разными референсными аллелями.
Из 20 аллелей MHC класса I, описанных здесь, 7 аллелей тесно связаны с одним или двумя другими, как показано на рис. 2. Возможность обнаружения ложных аллелей MHC класса I из ошибок амплификации ПЦР или событий рекомбинации была сведена к минимуму. за счет использования фермента высокой точности, небольшого количества циклов амплификации и консервативного метода определения аллелей.Наблюдение за тем, что макака 4241 может слабо отвечать на эпитоп KP9 при экспрессии аллеля Mane-A * 16 , а не Mane-A * 10 , предполагает, что эти близкородственные аллели обладают общей специфичностью связывания пептидов. Дальнейшие эксперименты с клетками C1R, трансфицированными аллелем Mane-A * 16 , могли продемонстрировать функциональную способность этого аллеля представлять эпитоп KP9.
В настоящее время имеется информация о 38 классических аллелях MHC класса I M. nemestrina , которую можно использовать для дальнейшего изучения.Теперь можно разработать праймеры, специфичные для последовательности, для обнаружения важных аллелей, таких как Mane-A * 10 , с помощью ПЦР, аналогично тестам, разработанным для макак-резусов (34, 39). Анализы на основе ПЦР, которые могут часто обнаруживать близкородственные аллели, впоследствии могут быть подтверждены RSCA, чувствительным к однонуклеотидным изменениям. Существование близкородственных аллелей было продемонстрировано аллелями Mane-A * 10 и Mane-A * 16 , идентифицированными в этом отчете, хотя оба эти аллеля, вероятно, представляют KP9.Праймеры, специфичные для последовательности, должны уметь различать Mane-A * 10 и Mane-A * 16 . Также может быть разработан тетрамерный реагент Mane-A * 10-KP9, позволяющий более детально изучить роль KP9-специфических CD8 + Т-клеток, способствуя нашему пониманию Т-клеточного иммунного давления, применяемого после вакцинации и во время курса. инфекции. Кроме того, отбор Mane-A * 10 -позитивных макак для испытаний вакцины позволит провести более надежное сравнение схем вакцинации и будет способствовать лучшему пониманию характеристик видоспецифичных иммунных ответов на SIV и SHIV.Представление только эпитопа KP9 дает макакам с косичками преимущество в борьбе с острой инфекцией SIV. Подобный эффект наблюдался у Mamu-A * 01 -позитивных макак-резусов (47, 50, 65), но это первое наблюдение у дополнительных видов приматов, кроме человека. Дальнейший анализ должен прояснить механизм и иммунологическое преимущество, обеспечиваемое KP9-специфическим Т-клеточным ответом CD8 + во время как острой, так и хронической инфекции SIV.
Доминантные Т-клеточные ответы, хотя и часто эффективны, могут быть подорваны появлением и поддержанием ускользания вируса по иммунодоминантным эпитопам, что приводит к прогрессированию заболевания (10, 11, 13, 28).Недавно мы идентифицировали Mane-A * 10 и Mane-A * 16 -позитивные макаки, инфицированные штаммами SHIV, содержащими мутации в положениях 2 и 9 эпитопа KP9, которые представляют собой мутации ускользания (CS Fernandez et al., Представленный для публикации). Определение субдоминантных эпитопов в этом исследовании, таких как YP8 (ограничено Mane-A * 11 / Mane-A * 12 ) и KW9 (ограничено Mane-A * 14 или Mane-B * 10 ), теперь позволяет проанализировать роль субдоминантных Т-клеточных ответов.Особый интерес представляет, когда ответчики KP9 также представляют эти субдоминантные эпитопы (например, у животных 4295, 4296 и 4293) и где ускользание происходит в доминантном эпитопе, и субдоминантные ответы становятся критическими. Недавно мы картировали дополнительные 12 Т-клеточных эпитопов CD8 + в M. nemestrina и теперь сосредоточены на определении ограничения MHC класса I этих эпитопов и попытке сопоставить эти ответы с исходом инфекции SIV или SHIV.
Таким образом, мы идентифицировали иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп SIV Gag CD8 + , KP9, и его ограничивающий аллель MHC класса I, Mane-A * 10 , присутствующий в значительной части косичков.У невакцинированных макак ответы Т-клеток CD8 + на KP9 приводят к снижению вирусной нагрузки во время острой инфекции SIV, демонстрируя, что только этот иммунодоминантный ответ оказывает значительное влияние на исход инфекции SIV. Это имеет важное значение для будущих исследований, связанных с ВИЧ, для M. nemestrina . Изучение развития, кинетики и специфичности Т-клеточных ответов CD8 + , наряду с дальнейшим изучением ускользания вируса как по иммунодоминантным, так и по субдоминантным эпитопам у косичих макак, приведет к уточнению дизайна вакцины и внесет вклад в наше понимание защитных свойств. иммунитет к SIV и SHIV.
БЛАГОДАРНОСТИ
Мы благодарим Мэтью Лоу за помощь в статистическом анализе и Socheata Chea за общую помощь и подсчет лимфоцитов CD4 + .
Эта работа была поддержана грантами Австралийского национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям 251653, 251654 и 299907, а также наградами NIH R24-RR-15371, R24-RR-016038 и P51-RR-00167643.
СНОСКИ
- Получено 15 июня 2004 г.
- Принято 3 сентября 2004 г.
- Copyright © 2005 Американское общество микробиологии
ССЫЛКИ
- 1.№
Адамс, Э. Дж. И П. Пархэм. 2001. Видоспецифическая эволюция генов MHC класса I у высших приматов. Иммунол. Версия 183 : 41-64.
- 2.↵
Аллен, Т.М., П. Джинг, Б. Калор, Х. Хортон, Д.Х. О’Коннор, Т. Ханке, М. Пикарчик, Р. Руддерсдорф, Б. Р. Мот, К. Эмерсон, Н. Уилсон, Дж. Д. Лифсон, И. М. Беляков, Дж. А. Берзофски, К. Ван, Д. Б. Эллисон, Д. К. Монтефиори, Р. К. Дерозье, С. Волински, К. Дж. Кунстман, Дж.Д. Альтман, А. Сетт, А. Дж. Мак-Майкл и Д. И. Уоткинс. 2002. Действие цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), направленных против одного эпитопа Gag CTL вируса обезьяньего иммунодефицита (SIV), на течение инфекции SIVmac239. J. Virol.76 : 10507-10511.
- 3.↵
Аллен, Т.М., Б.Р. Мот, Дж. Сидни, П. Джинг, Дж.Л. Дзурис, М.Е. Либл, Т.Ю. Фогель, Д.Х. О’Коннор, Х. Ван, М.К. Вуссоу, Дж. А. Томсон, Дж. Д. Альтман, Д.И. Уоткинс и А. Сетт. 2001. CD8 (+) лимфоциты макак-резусов, инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян, распознают 14 различных эпитопов, связанных молекулой класса I главного комплекса гистосовместимости Mamu-A * 01: значение для разработки и тестирования вакцины. J. Virol. 75 : 738-749.
- 4.↵
Аллен, Т.М., Д.Х. О’Коннор, П. Джинг, Дж.Л. Дзурис, Б.Р. Моте, Т.Ю. Фогель, Э. Данфи, М.Э. Либл, К. Эмерсон, Н. Уилсон, К.Дж. Кунстман, X. Wang, DB Allison, ALХьюз, Р. К. Дерозье, Дж. Д. Альтман, С. М. Волински, А. Сетте и Д. И. Уоткинс. 2000. Tat-специфические цитотоксические Т-лимфоциты отбирают варианты ускользания от SIV во время разрешения первичной виремии. Nature407 : 386-390.
- 5.↵
Аллен, Т. М., Дж. Сидней, М. Ф. дель Герсио, Р. Л. Гликман, Г. Л. Ленсмейер, Д. А. Вибе, Р. Де Марс, К. Д. Пауза, Р. П. Джонсон, А. Сетте и Д. И. Уоткинс. 1998. Характеристика пептидного связывающего мотива молекулы резуса MHC класса I (Mamu-A * 01), которая связывает иммунодоминантный эпитоп CTL из вируса иммунодефицита обезьян.J. Immunol. 160 : 6062-6071.
- 6.↵
Amara, RR, F. Villinger, JD Altman, SL Lydy, SP O’Neil, SI Staprans, DC Montefiori, Y. Xu, JG Herndon, LS Wyatt, MA Candido, NL Kozyr , PL Earl, JM Smith, HL Ma, BD Grimm, ML Hulsey, J. Miller, HM McClure, JM McNicholl, B. Moss и HL Robinson. 2001. Контроль заражения слизистой оболочки и профилактика СПИДа с помощью вакцины с несколькими белками ДНК / MVA. Science292 : 69-74.
- 7.↵
Аргуэлло, Дж. Р., А. М. Литтл, Э. Бохан, Дж. М. Голдман, С. Г. Марш и Дж. А. Мадригал. 1998. Типирование HLA класса I с высоким разрешением с помощью конформационного анализа, опосредованного эталонной цепью (RSCA). Тканевые антигены 52 : 57-66.
- 8.
Barnstable, C. J., W. F. Bodmer, G. Brown, G. Galfre, C. Milstein, A. F. Williams и A. Ziegler. 1978. Производство моноклональных антител к эритроцитам группы А, HLA и другим поверхностным антигенам клеток человека — новые инструменты для генетического анализа.Cell14 : 9-20.
- 9.↵
Barouch, DH, A. Craiu, S. Santra, MA Egan, JE Schmitz, MJ Kuroda, TM Fu, JH Nam, LS Wyatt, MA Lifton, GR Krivulka, CE Nickerson, CI Лорд, Б. Мосс, М. Г. Льюис, В. М. Хирш, Дж. У. Шивер и Н. Л. Летвин. 2001. Выявление высокочастотных реакций цитотоксических Т-лимфоцитов против как доминантных, так и субдоминантных эпитопов вируса иммунодефицита обезьян и человека путем ДНК-вакцинации макак-резусов.J. Virol. 75, : 2462-2467.
- 10.↵
Barouch, DH, J. Kunstman, J. Glowczwskie, KJ Kunstman, MA Egan, FW Peyerl, S. Santra, MJ Kuroda, JE Schmitz, K. Beaudry, GR Krivulka, MA Lifton , Д.А. Горгон, С.М. Волинский, Н.Л. Летвин. 2003. Ускользание вируса от доминантных цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных для эпитопа вируса обезьяньего иммунодефицита, у ДНК-вакцинированных макак-резусов. J. Virol. 77 : 7367-7375.
- 11.↵
Barouch, DH, J. Kunstman, MJ Kuroda, JE Schmitz, S. Santra, FW Peyerl, GR Krivulka, K. Beaudry, MA Lifton, DA Gorgone, DC Montefiori, MG Lewis, SM Wolinsky, and NL Letvin . 2002. Возможная неудача вакцины против СПИДа у макаки-резуса из-за ускользания вируса от цитотоксических Т-лимфоцитов. Nature415 : 335-339.
- 12.↵
Barouch, D. H., S. Santra, J. E. Schmitz, M. J. Kuroda, T. M. Fu, W. Wagner, M. Bilska, A.Крайу, ХХ Чжэн, Г.Р. Кривулка, К. Бодри, М.А. Лифтон, К.Э. Никерсон, У.Л. Тригона, К. Пунт, Д.К. Фрид, Л. Гуан, С. Дубей, Д. Казимиро, А. Саймон, М. Е. Дэвис, М. Честейн , Т. Б. Стром, Р. С. Гельман, Д. К. Монтефиори, М. Г. Льюис, Е. А. Эмини, Дж. У. Шивер и Н. Л. Летвин. 2000. Контроль виремии и профилактика клинического СПИДа у макак-резусов путем вакцинации ДНК с добавлением цитокинов. Science290 : 486-492.
- 13.↵
Заём, П., Х. Левики, Х. Вей, М. С. Хорвиц, Н. Пеффер, Х. Мейерс, Дж. А. Нельсон, Дж. Э. Гайрин, Б. Х. Хан, М. Б. А. Олдстон и Г. М. Шоу. 1997. Противовирусное давление, оказываемое ВИЧ-1-специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) во время первичной инфекции, продемонстрировано быстрым отбором ускользающего вируса CTL. Nat. Med.3 : 205-211.
- 14.
Бойсон, Дж. Э., К. Шаффлеботэм, Л. Ф. Кадавид, Дж. А. Урватер, Л. А. Кнапп, А. Л. Хьюз и Д. И. Уоткинс. 1996 г.Гены MHC класса I макаки-резуса. Различная эволюционная история генов MHC I и II классов у приматов. J. Immunol. 156 : 4656-4665.
- 15.↵
Buch, SJ, F. Villinger, D. Pinson, Y. Hou, I. Adany, Z. Li, R. Dalal, R. Raghavan, A. Kumar, and O. Narayan . 2002. Врожденные различия между макаками-макаками, инфицированными обезьянами и вирусом иммунодефицита (SHIV) (KU-2), в развитии неврологических заболеваний. Вирусология 295 : 54-62.
- 16.
Chen, Z., X. Zhao, Y. Huang, A. Gettie, L. Ba, J. Blanchard, and D. D. Ho. 2002. CD4 + лимфоцитопения при острой инфекции азиатских макак вагинально передаваемым подтипом C, CCR5-тропным вирусом иммунодефицита обезьян / человека (SHIV). J. Acquir. Иммунодефицит. Syndr.30 : 133-145.
- 17.↵
Чен, З. В., А. Крайу, Л. Шен, М. Дж. Курода, У. К. Ироку, Д. И. Уоткинс, Г. Восс и Н. Л. Летвин. 2000. Вирус иммунодефицита обезьян уклоняется от доминантного эпитоп-специфического ответа цитотоксических Т-лимфоцитов посредством мутации, приводящей к ускоренной диссоциации вирусного пептида и MHC класса I. J. Immunol. 164 : 6474-6479.
- 18.↵
Cho, MW, YB Kim, MK Lee, KC Gupta, W. Ross, R. Plishka, A. Buckler-White, T. Igarashi, T. Theodore, R. Byrum, C. Кемп, Д. К. Монтефиори и М. А. Мартин. 2001. Вакцина с поливалентным гликопротеином оболочки вызывает более широкий нейтрализующий ответ антител, но неспособна обеспечить стерилизующую защиту от инфекции гетерологичного вируса иммунодефицита обезьян / человека у макак с косичками.J. Virol. 75, : , 2224-2234.
- 19.↵
Коэн, Дж. 2000. Исследование СПИДа. Исследования вакцин застопорились из-за нехватки животных. Science 287 : 959-960.
- 20.↵
Дейл, С.Дж., Р. Де Роуз, И. Стратов, С. Чеа, Д. Монтефиори, С. А. Томсон, И. А. Рэмшоу, Б. Э. Коупар, Д. Б. Бойл, М. Лоу и С. Дж. Кент . Эффективность первичных / буст-вакцин ДНК и вируса поксвируса птиц против SHIV. J. Virol., В печати.
- 21.↵
Дейл, К. Дж., Х. С. Лю, Р. Де Роуз, Д. Ф. Перселл, Дж. Андерсон, Ю. Сюй, Г. Р. Леггатт, И. Х. Фрейзер и С. Дж. Кент. 2002. Вакцины на основе химерного вируса папилломы человека-обезьян / вируса иммунодефицита человека: иммуногенность и защитная эффективность у макак. Вирусология 301 : 176-187.
- 22.↵
Дориа-Роуз, Н. А., К. Олен, П. Полачино, К. К. Пирс, М. Т. Хенсель, Л. Куллер, Т. Малвания, Д. Андерсон, П. Д. Гринберг, С.Л. Ху и Н. Л. Хейгвуд. 2003. Вакцины, стимулирующие прайминг-бустинг мультигенной ДНК, защищают макак от острого истощения CD4 + -T-клеток после заражения слизистой оболочки вируса иммунодефицита обезьяны и человека SHIV89.6P. J. Virol. 77 : 11563-11577.
- 23.
Дрейк, Дж. Дж., Л. Дж. Кеннеди, Х. К. Оти, Р. Ривар, У. Э. Олли, А. К. Китченер, А. Р. Фриман и А. Д. Рэдфорд. 2004. Использование референс-опосредованного конформационного анализа для изучения полиморфизма DRB класса II лейкоцитарного антигена гепарда (Acinonyx jubatus) кошек.Мол. Ecol.13 : 221-229.
- 24.↵
Иган, М. А., М. Дж. Курода, Г. Восс, Дж. Э. Шмитц, В. А. Чарини, К. И. Лорд, М. А. Форман и Н. Л. Летвин. 1999. Использование тетрамеров основного комплекса гистосовместимости класса I / пептид / β2M для количественного определения CD8 (+) цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных для доминантных и недоминантных вирусных эпитопов у обезьян-людей, инфицированных вирусом иммунодефицита макак-резус. J. Virol.73 : 5466-5472.
- 25.↵
Evans, DT, DH O’Connor, P. Jing, JL Dzuris, J. Sidney, J. da Silva, TM Allen, H. Horton, JE Venham, RA Rudersdorf, T. Vogel, CD Pauza, RE Бонтроп, Р. ДеМарс, А. Сетте, А.Л. Хьюз и Д.И. Уоткинс. 1999. Вирус-специфические реакции цитотоксических Т-лимфоцитов выбирают аминокислотную вариацию в вирусе обезьяньего иммунодефицита Env и Nef. Nat. Med.5 : 1270-1276.
- 26.↵
Фрам, Н., Б. Т. Корбер, К.M. Adams, JJ Szinger, R. Draenert, MM Addo, ME Feeney, K. Yusim, K. Sango, NV Brown, D. SenGupta, A. Piechocka-Trocha, T. Simonis, FM Marincola, AG Wurcel, DR Stone , С. Дж. Рассел, П. Адольф, Д. Коэн, Т. Роуч, А. Сент-Джон, А. Хатри, К. Дэвис, Дж. Маллинс, П. Дж. Гоулдер, Б. Д. Уокер и К. Брандер. 2004. Последовательное нацеливание цитотоксических Т-лимфоцитов на иммунодоминантные области вируса иммунодефицита человека у представителей разных национальностей. J. Virol. 78, : , 2187-2200.
- 27.↵
Gorelick, RJ, RE Benveniste, JD Lifson, JL Yovandich, WR Morton, L. Kuller, BM Flynn, BA Fisher, JL Rossio, M. Piatak, Jr., JW Bess, Jr ., Л.Е. Хендерсон и Л.О. Артур. 2000. Защита Macaca nemestrina от заболевания, вызванного заражением патогенным вирусом иммунодефицита обезьян (SIV): использование вакцин с мутантной ДНК нуклеокапсида SIV с усилением белка SIV и без него. J. Virol. 74, : , 11935-11949.
- 28.↵
Goulder, PJ, RE Phillips, RA Colbert, SN McAdam, GS Ogg, MA Nowak, P. Giangrande, G. Luzzi, B. Morgan, A. Edwards, AJ McMichael, and SL Роуленд-Джонс. 1997. Поздний уход от иммунодоминантного ответа цитотоксических Т-лимфоцитов, связанного с прогрессированием СПИДа. Nat. Med.3 : 212-217.
- 29.↵
Harouse, J. M., A. Gettie, R.C. Tan, J. Blanchard и C. Cheng-Mayer. 1999. Отчетливые патогенные последствия у макак-резусов, инфицированных CCR5 или CXCR4 с использованием SHIV. Science 284 : 816-819.
- 30.↵
Джин, X., DE Bauer, SE Tuttleton, S.Lewin, A. Gettie, J. Blanchard, CE Irwin, JT Safrit, J. Mittler, L. Weinberger, LG Kostrikis, Л. Чжан, А.С. Перельсон, Д.Д. Хо. 1999. Резкое увеличение плазменной виремии после истощения CD8 + Т-лимфоцитов у макак, инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян.J. Exp. Мед. 189 : 991-998.
- 31.
Кент, С. Дж., К. Дж. Дейл, С. Прейсс, Дж. Миллс, Д. Кампанья и Д. Ф. Перселл. 2001. Вакцинация ослабленным вирусом обезьяньего иммунодефицита путем посева ДНК. J. Virol. 75, : , 11930-11934.
- 32.↵
Кент, С. Дж., А. Чжао, С. Дж. Бест, Дж. Д. Чендлер, Д. Б. Бойл и И. А. Рэмшоу. 1998. Повышенная Т-клеточная иммуногенность и защитная эффективность схемы вакцинации против вируса иммунодефицита человека типа 1, состоящей из последовательного праймирования ДНК и бустинга рекомбинантным вирусом оспы птиц.J. Virol.72 : 10180-10188.
- 33.↵
Клавинскис, Л. С., Дж. Л. Уиттон и М. Б. Олдстон. 1989. Созданная методом молекулярной инженерии вакцина, которая экспрессирует иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, индуцирует цитотоксические Т-лимфоциты, которые обеспечивают защиту от летальной вирусной инфекции. J. Virol. 63 : 4311-4316.
- 34.↵
Кнапп, Л. А., Э. Леманн, М. С. Пекарчик, Дж. А. Урватер и Д. И. Уоткинс. 1997 г.Высокая частота Mamu-A * 01 у макака-резуса обнаружена с помощью полимеразной цепной реакции с последовательностью-специфическими праймерами и прямого секвенирования. Тканевые антигены 50 : 657-661.
- 35.↵
Куп, Р. А., Дж. Т. Сафрит, Ю. Цао, К. А. Эндрюс, Г. Маклеод, В. Борковски, К. Фартинг и Д. Д. Хо. 1994. Временная ассоциация клеточных иммунных ответов с начальным контролем виремии при синдроме первичного вируса иммунодефицита человека 1 типа. J. Virol.68 : 4650-4655.
- 36.↵
Куикен, К. Л., Б. Фоли, Э. Фрид, Б. Хан, Б. Корбер, М. П. А., Ф. Маккатчан, Дж. У. Меллорс и С. Волински (ред.). 2002. Сборник последовательностей ВИЧ. Группа теоретической биологии и биофизики, Лос-Аламосская национальная лаборатория, Лос-Аламос, Нью-Мексико,
- 37.↵
Курода, MJ, JE Schmitz, DH Barouch, A. Craiu, TM Allen, A. Sette, D.I Watkins, MA Форман, Н.Л. Летвин. 1998. Анализ Gag-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов у обезьян-резусов, инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян, путем окрашивания клеток тетрамерным комплексом класса I-пептидный комплекс главного комплекса гистосовместимости. J. Exp. Мед. 187 : 1373-1381.
- 38.↵
Лафонт, Б. А., А. Баклер-Уайт, Р. Плишка, К. Баклер и М. А. Мартин. 2003. Характеристика классических генов MHC класса I у коснохвостых макак: значение для эволюции MHC и презентации антигена у макак.J. Immunol. 171 : 875-885.
- 39.↵
Лобашевский, А. Л., Дж. М. Томас. 2000. Шесть аллелей локуса mamu-A, определенные с помощью метода праймеров, специфичных для последовательности полимеразной цепной реакции. Гм. Immunol.61 : 1013-1020.
- 40.↵
Maecker, HT, HS Dunn, MA Suni, E. Khatamzas, CJ Pitcher, T. Bunde, N. Persaud, W. Trigona, TM Fu, E. Sinclair, BM Bredt, JM МакКьюн, В.К. Майно, Ф. Керн и Л.Дж. Пикер. 2001. Использование перекрывающихся пептидных смесей в качестве антигенов для цитокиновой проточной цитометрии. J. Immunol. Методы255 : 27-40.
- 41.↵
МакКонки, SJ, WH Reece, VS Moorthy, D. Webster, S. Dunachie, G. Butcher, JM Vuola, TJ Blanchard, P. Gothard, K. Watkins, CM Hannan, S. Эверари, К. Браун, К. Э. Кестер, Дж. Каммингс, Дж. Уильямс, Д. Г. Хеппнер, А. Патан, К. Фланаган, Н. Аруланантам, М. Т. Робертс, М. Рой, Г. Л. Смит, Дж.Шнайдер, Т. Пето, Р. Э. Синден, С. К. Гилберт и А. В. Хилл. 2003. Повышенная Т-клеточная иммуногенность вакцин плазмидной ДНК, усиленных рекомбинантным модифицированным вирусом осповакцины Анкара, у людей. Nat. Med.9 : 729-735.
- 42.↵
McMichael, A. J. и S. L. Rowland-Jones. 2001. Клеточные иммунные ответы на ВИЧ. Nature410 : 980-987.
- 43.↵
Миллер, М. Д., Х. Ямамото, А. Л. Хьюз, Д.И. Уоткинс, Н. Л. Летвин. 1991. Определение эпитопа и молекулы MHC класса I, распознаваемой gag-специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами у SIVmac-инфицированных макак-резусов. J. Immunol. 147 : 320-329.
- 44.↵
Mothé, BR, H. Horton, DK Carter, TM Allen, ME Liebl, P. Skinner, T.U Vogel, S. Fuenger, K. Vielhuber, W. Rehrauer, N. Wilson, Дж. Франчини, Дж. Д. Альтман, А. Хааз, Л. Дж. Пикер, Д. Б. Эллисон и Д. И. Уоткинс. 2002 г.Преобладание ответов CD8, специфичных для эпитопов, связанных с одной молекулой класса I главного комплекса гистосовместимости, во время острой фазы вирусной инфекции. J. Virol. 76, : , 875-884.
- 45.↵
Musey, L., J. Hughes, T. Schacker, T. Shea, L. Corey и M. J. McElrath. 1997. Ответы цитотоксических Т-клеток, вирусная нагрузка и прогрессирование заболевания при ранней инфекции вируса иммунодефицита человека 1 типа. N. Engl. J. Med. 337 : 1267-1274.
- 46.↵
О’Коннор, Д. Х., Т. М. Аллен и Д. И. Уоткинс. 2001. Куда пропали все обезьяны ?: оценка специфичных для SIV CTL в эпоху после Mamu-A * 01. В Б. Корбер, К. Брандер, Б. Хейнс, Р. А. Куп, К. Куикен, Дж. П. Мур, Б. Д. Уокер и Д. И. Уоткинс (ред.), Молекулярная иммунология ВИЧ. Лос-Аламосская национальная лаборатория теоретической биологии и биофизики, Лос-Аламос, Нью-Мексико,
- 47.↵
О’Коннор, Д. Х., Б. Р. Моте, Дж. Т. Вайнфуртер, С.Fuenger, WM Rehrauer, P. Jing, RR Rudersdorf, ME Liebl, K. Krebs, J. Vasquez, E. Dodds, J. Loffredo, S. Martin, AB McDermott, TM Allen, C. Wang, GG Doxiadis, DC Montefiori , А. Хьюз, Д. Р. Бертон, Д. Б. Эллисон, С. М. Волински, Р. Бонтроп, Л. Дж. Пикер и Д. И. Уоткинс. 2003. Аллели основного комплекса гистосовместимости класса I, ассоциированные с медленным прогрессированием обезьяньего вируса иммунодефицита, связывают эпитопы, распознаваемые доминантными острофазовыми ответами цитотоксических Т-лимфоцитов.J. Virol.77 : 9029-9040.
- 48.↵
О’Коннор, Д. Х. и Д. И. Уоткинс. 1999. Коробка Гудини: к пониманию ускользания вируса СПИДа от ответа цитотоксических Т-лимфоцитов. Immunogenetics50 : 237-241.
- 49.↵
Ogg, GS, X. Jin, S. Bonhoeffer, PR Dunbar, MA Nowak, S. Monard, JP Segal, Y. Cao, SL Rowland-Jones, V. Cerundolo, A. Херли, М. Марковиц, Д. Д. Хо, Д. Ф.Никсон и А. Дж. Мак-Майкл. 1998. Количественное определение ВИЧ-1-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и плазменной нагрузки вирусной РНК. Science279 : 2103-2106.
- 50.↵
Пал, Р., Д. Вензон, Н. Л. Летвин, С. Сантра, Д. К. Монтефиори, Н. Р. Миллер, Э. Тринишевска, М. Г. Льюис, Т. К. Ванкотт, В. Хирш, Р. Вудворд, А. Гибсон, М. Грейс, Э. Добрац, П. Д. Маркхэм, З. Хель, Дж. Накса, М. Кляйн, Дж. Тарталья и Дж. Франкини. 2002. Вакцинация на основе ALVAC-SIV-gag-pol-env и основной комплекс гистосовместимости макак класса I (A * 01) задерживают иммунодефицит, вызванный вирусом иммунодефицита обезьян, вызванный вирусом SIVmac.J. Virol.76 : 292-302.
- 51.↵
Parham, P., C.J. Barnstable и W.F.Bodmer. 1979. Использование моноклональных антител (W6 / 32) в структурных исследованиях антигенов HLA-A, B, C. J. Immunol. 123 : 342-349.
- 52.
Патель, П. Г., М. Т. Ю. Кимата, Дж. Э. Биггинс, Дж. М. Уилсон и Дж. Т. Кимата. 2002. Высокопатогенные варианты мнемонического вируса обезьяньего иммунодефицита, которые появляются в ходе инфекции, развивают повышенную инфекционность и способность подавлять регуляцию CD4, но не антигенов главного комплекса гистосовместимости класса I.J. Virol.76 : 6425-6434.
- 53.↵
Romano, J. W., R. N. Shurtliff, E. Dobratz, A. Gibson, K. Hickman, P. D. Markham, and R. Pal. 2000. Количественная оценка заражения вирусом иммунодефицита обезьян с использованием технологии NASBA. J. Virol. Методы 86 : 61-70.
- 54.↵
Russell, N. D., M. G. Hudgens, R. Ha, C. Havenar-Daughton, and M. J. McElrath. 2003. Переход к испытаниям эффективности вакцины против вируса иммунодефицита человека типа 1: определение Т-клеточных ответов как потенциальных коррелятов иммунитета.J. Infect. Dis.187 : 226-242.
- 55.↵
Сапер, М. А., П. Дж. Бьоркман и Д. К. Вили. 1991. Уточнена структура антигена гистосовместимости человека HLA-A2 с разрешением 2,6 Å. J. Mol. Biol. 219 : 277-319.
- 56.↵
Schmitz, JE, MJ Kuroda, S. Santra, VG Sasseville, MA Simon, MA Lifton, P. Racz, K. Tenner-Racz, M. Dalesandro, BJ Scallon, J. Ghrayeb , М.А. Форман, Д.К. Монтефиори, Э. П. Рибер, Н. Л. Летвин и К. А. Рейманн. 1999. Контроль виремии при инфицировании вирусом иммунодефицита обезьян CD8 + лимфоцитами. Science283 : 857-860.
- 57.↵
Шен, Ю., Д. Чжоу, Л. Чалифу, Л. Шен, М. Саймон, X. Цзэн, X. Лай, Ю. Ли, П. Сегал, Н. Л. Летвин, и З. В. Чен. 2002. Индуцирование туберкулезоподобного заболевания, связанного с вирусом СПИДа, у макак: модель коинфекции вируса иммунодефицита обезьян и микобактерий.Заразить. Immun.70 : 869-877.
- 58.↵
Shiver, JW, TM Fu, L. Chen, D. Casimiro, ME Davies, RK Evans, ZQ Zhang, AJ Simon, WL Trigona, SA Dubey, L. Huang, VA Harris, RS Long, X. Liang, L. Handt, WA Schleif, L. Zhu, DC Freed, NV Persaud, L. Guan, KS Punt, A. Tang, M. Chen, KA Wilson, KB Collins, GJ Heidecker, VR Fernandez , ХК Перри, Дж. Дж. Джойс, К. М. Гримм, Дж. К. Кук, П. М. Келлер, Д. С. Кресок, Х.Мах, Р. Д. Траутман, Л. А. Изопи, Д. М. Уильямс, З. Сюй, К. Э. Боханнон, Д. Б. Волкин, Д. К. Монтефиори, А. Миура, Г. Р. Кривулка, М. А. Лифтон, М. Дж. Курода, Дж. Э. Шмитц, Н. Л. Летвин, М. Дж. Колфилд, А. Дж. Бетт, Р. Юил, Д. К. Каслоу и Е. А. Эмини. 2002. Неспособный к репликации вектор аденовирусной вакцины вызывает эффективный иммунитет против вируса иммунодефицита. Nature415 : 331-335.
- 59.↵
Тернер, Д., С. Акпе, Дж. Браун, К. Браун, А.Маквинни, А. Мадригал и К. Наваррете. 2001. HLA-B-типирование с помощью конформационного анализа, опосредованного эталонной цепью, с использованием капиллярного полуавтоматического генетического анализатора. Гм. Immunol.62 : 414-418.
- 60.↵
Vogel, T. U., B. E. Beer, J. zur Megede, H. G. Ihlenfeldt, G. Jung, S. Holzammer, D. I. Watkins, J. D. Altman, R. Kurth и S. Norley. 2002. Индукция клеточного и гуморального иммунного ответа против вируса обезьяньего иммунодефицита у макак-резусов пептидными иммуногенами: корреляция активности CTL и снижения связанной с клетками, но не плазменной вирусной нагрузки после заражения.J. Gen. Virol. 83 : 81-91.
- 61.↵
Ямамото, Х., М. Д. Миллер, Х. Цубота, Д. И. Уоткинс, Г. П. Маццара, В. Сталлард, Д. Л. Паникали, А. Альдовини, Р. А. Янг и Н. Л. Летвин. 1990. Исследования клонированных Т-лимфоцитов, специфичных к вирусу иммунодефицита обезьян. gag-специфические цитотоксические Т-лимфоциты проявляют ограниченную эпитопную специфичность. J. Immunol. 144 : 3385-3391.
- 62.↵
Янг, А.С., С. Г. Натенсон и Дж. К. Саккеттини. 1995. Структурные исследования белков главного комплекса гистосовместимости класса I: понимание представления антигена. FASEB J.9 : 26-36.
- 63.↵
Yu, X. G., M. M. Addo, E. S. Rosenberg, W. R. Rodriguez, P. K. Lee, C. A. Fitzpatrick, M. N. Johnston, D. Strick, P. J. Goulder, B. D. Walker, and M. Altfeld. 2002. Согласованные закономерности в развитии и иммунодоминировании Т-клеточных ответов CD8 +, специфичных к вирусу иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), после острой инфекции ВИЧ-1.J. Virol. 76, : , 8690-8701.
- 64.↵
Zemmour, J., A.M Little, D. J. Schendel, and P. Parham. 1992. HLA-A, B «отрицательная» мутантная клеточная линия C1R экспрессирует новый аллель HLA-B35, который также имеет точечную мутацию в кодоне инициации трансляции. J. Immunol. 148 : 1941-1948.
- 65.↵
Zhang, Z. Q., T. M. Fu, D. Casimiro, M. E. Davies, X. Liang, W. A. Schleif, L. Handt, L. Tussey, M. Chen, A.Тан, К. А. Уилсон, В. Л. Тригона, Д. К. Фрид, К. Ю. Тан, М. Хортон, Э. А. Эмини и Дж. У. Шивер. 2002. Опосредованное аллелем Mamu-A * 01 ослабление прогрессирования заболевания при инфицировании вирусом иммунодефицита обезьян и человека. J. Virol. 76, : , 12845-12854.
% PDF-1.6 % 528 0 объект > эндобдж xref 528 129 0000000016 00000 н. 0000004226 00000 п. 0000004363 00000 п. 0000004580 00000 н. 0000004624 00000 н. 0000004753 00000 н. 0000005673 00000 п. 0000005710 00000 н. 0000005824 00000 н. 0000005938 00000 н. 0000008850 00000 н. 0000012136 00000 п. 0000015585 00000 п. 0000015697 00000 п. 0000018825 00000 п. 0000021399 00000 н. 0000021634 00000 п. 0000021907 00000 п. 0000024655 00000 п. 0000024928 00000 п. 0000025181 00000 п. 0000025208 00000 п. 0000025467 00000 п. 0000025768 00000 п. 0000026042 00000 п. 0000026406 00000 п. 0000026914 00000 п. 0000027361 00000 п. 0000027502 00000 н. 0000030234 00000 п. 0000033009 00000 п. 0000033425 00000 п. 0000033548 00000 п. 0000033968 00000 п. 0000034198 00000 п. 0000034295 00000 п. 0000034951 00000 п. 0000036536 00000 п. 0000041457 00000 п. 0000046245 00000 п. 0000046413 00000 п. 0000046675 00000 п. 0000047182 00000 п. 0000047252 00000 п. 0000049901 00000 н. 0000051275 00000 п. 0000051543 00000 п. 00000 00000 н. 0000101027 00000 н. 0000101341 00000 н. 0000101438 00000 п. 0000101629 00000 н. 0000101820 00000 н. 0000102016 00000 н. 0000102212 00000 н. 0000102403 00000 н. 0000102631 00000 н. 0000103051 00000 н. 0000103172 00000 п. 0000103353 00000 п. 0000103773 00000 п. 0000103870 00000 п. 0000104059 00000 н. 0000104479 00000 п. 0000104576 00000 н. 0000104766 00000 н. 0000105186 00000 п. 0000105283 00000 п. 0000105471 00000 п. 0000105701 00000 п. 0000106117 00000 п. 0000106240 00000 н. 0000106436 00000 н. 0000106632 00000 н. 0000106822 00000 н. 0000120240 00000 н. 0000131137 00000 н. 0000139161 00000 п. 0000226257 00000 н. 0000231353 00000 н. 0000236254 00000 н. 0000241302 00000 н. 0000255098 00000 н. 0000265243 00000 п. 0000270097 00000 н. 0000274986 00000 н. 0000281017 00000 н. 0000286835 00000 н. 0000295813 00000 н. 0000303898 00000 н. 0000303970 00000 н. 0000304114 00000 п. 0000304264 00000 н. 0000304308 00000 н. 0000304463 00000 н. 0000304507 00000 н. 0000304707 00000 н. 0000304751 00000 п. 0000304906 00000 н. 0000304950 00000 н. 0000305063 00000 н. 0000305182 00000 н. 0000305377 00000 н. 0000305421 00000 н. 0000305534 00000 н. 0000305682 00000 н. 0000305786 00000 н. 0000305830 00000 н. 0000306008 00000 п. 0000306052 00000 н. 0000306213 00000 н. 0000306385 00000 н. 0000306479 00000 н. 0000306523 00000 н. 0000306624 00000 н. 0000306666 00000 н. 0000306710 00000 н. 0000306889 00000 н. 0000306933 00000 н. 0000306977 00000 н. 0000307021 00000 н. 0000307202 00000 н. 0000307246 00000 н. 0000307429 00000 н. 0000307473 00000 н. 0000307517 00000 н. 0000307561 00000 н. 0000307605 00000 н. 0000002932 00000 н. трейлер ] / Назад 3882513 >> startxref 0 %% EOF 656 0 объект > поток , $ `= b {ێ _ * \ EIXB + 3qEU) aFIN` {,} ړ H [SNj1qrx, 6vZDE4 + : R,> j3
Шитье JANOME MB-4 ВЫШИВКА 6 ЧЕХОЛОВ ДЛЯ КОСЯЧЕЙ # 541678 6PCS Ремесленные платформы.com
Шитье JANOME MB-4 ВЫШИВКА 6 ЧЕХОЛОВ ДЛЯ КОШЕК # 541678 6PCS Crafts marketplatforms.comШитье JANOME MB-4 ВЫШИВКА 6 ЧЕХЛОВ ДЛЯ ВОЛОС # 541678 Поделки из 6 предметов, ЧЕХЛЫ ДЛЯ ВОЛОС JANOME MB-4 6 ШТ. СЛУЧАИ # 541678 6PCS по лучшим онлайн-ценам, Бесплатная доставка для многих продуктов # 541678 6PCS JANOME MB-4 ВЫШИВКА 6 ЧЕХОВ ДЛЯ БОББИН С КОСКАМИ.
JANOME MB-4 ВЫШИВКА НА 6 ЧЕХЛОВ ДЛЯ КОШЕК # 541678 6 ШТ.
JANOME MB-4 ВЫШИВКА НА 6 ЧЕХЛОВ С КОСКАМИ # 541678 6 ШТ.
Найдите много отличных новых и бывших в употреблении опций и получите лучшие предложения на JANOME MB-4 ВЫШИВКА 6 ЧЕХЛОВ ДЛЯ КОШЕК # 541678 6 ШТ. По лучшим онлайн-ценам! Бесплатная доставка для многих товаров! Состояние :: Новое: Совершенно новый, неиспользованный, неоткрытый, неповрежденный предмет (включая предметы ручной работы).См. Список продавца для получения полной информации. См. Все определения условий: Бренд:: Универсальный, Материал:: Металл: MPN:: ВЫШИВКАBCSMALL, Ремесло:: Шитье: Страна / регион производства:: Китай, Продукт:: Колпачок: Модель:: Размер L маленький, Тип изделия: : Детали, аксессуары и приспособления: UPC:: Не применяется,
JANOME MB-4 ВЫШИВКА НА 6 ЧЕХЛОВ ДЛЯ КОШЕК # 541678 6 ШТ.
Изображение доступно на различных изделиях: занавески для душа. 45 мм; Резьба винта: M3 / (3 мм) с шагом резьбы: 0, Select Your Favorite From Highballs — 17 унций -, Два задних кармана для удобного хранения.Режет записки Бумага Ангел на Луне Вырезывание Тиснение Плашки Карточки Ремесло из металла. Стерлинговое серебро 925 пробы Ожерелье с подвеской в виде фигуры клоуна Серебряное винтажное римское креативное ожерелье для женщин Фестиваль ювелирных изделий серебряный цвет: Clothing. Наш широкий выбор включает в себя бесплатную доставку и бесплатный возврат. Дата первого упоминания: 2 августа. Серьги Faith Post из серебра 925 пробы Diamond2Deal: Одежда. BABY SWAG Ref bbab95 Наклейка автоколланта Bébé à Bord. Ювелирные изделия и обслуживание высокого качества. Купите обручальные кольца Классические ремешки Плоские обручальные кольца с кромкой из титана с ребристым краем 7 мм, матовый и полированный ремешок размера 5 и другие обручальные кольца в, Купите плоские мужские и женские простые обручальные кольца из желтого золота 14 карат 2 мм плоские и другие обручальные кольца в, восемь синих витражей восемь прозрачных стеклянных окон с синими кукурузными цветами внутри.Мини-роботы для уборки пыли с автоматическим вращающимся шариком, электрические пылесосы, они предназначены для круглогодичного использования во всех климатических условиях, если вы недовольны по какой-либо причине, складываемое кольцо с золотым наполнением Twig Rustic Handcrafted Minimist. Вам понравится форма и ощущение этой супер мягкой футболки, Универсальный шланг для инструментов из ПВХ для стиральной машины с впуском воды из ПВХ, универсальный 1 шт. CO, ******** >>>>>>> Это персонализированный и изделие на заказ. * Выберите стиль шрифта из раскрывающегося меню. Толстовка «Stanley and Stella», которую я использую, высшего качества, наше текущее время выполнения работ до 2 недель. Новый карбюратор CARBURETOR ПОДХОДИТ ДЛЯ ЦЕПНОЙ ПИЛЫ STIHL MS170 MS180 017 018 для продажи Zama.【Гарантированное качество】 Комплект верхних нижних прокладок верхней части головки высшего качества. Идеально подходит для котлов с высоким перепадом давления. Оцинковано для защиты от коррозии. Идеально подходит для двойных дверей, а также комбинаций передней / задней части и крыльца / фасада. Семена ирландского клевера трилистника с бесплатным подарком на новый год. Клей с низкой липкостью, который предпочитают многие спортсмены, прочно прилегает к выступающей поверхности. отличный выбор для чувствительных ушей для снижения риска. регулируемые ремни и пять причудливых персонажей на выбор, 1 новый черный хлопок 24×54 кабана, полотенца для бассейна, полотенца для бассейна, пляжные полотенца для бассейна.Универсальный карман с быстрым доступом; оригинальные молнии YKK.
ЧТО
МЫ ДЕЛАЕМКомпании, занимающиеся созданием новых платформ, проходят трудный путь от прекрасной идеи до достижения критической массы, необходимой для зажигания и роста. MPD Advisors разрабатывает стратегии и тактику зажигания, дает советы по дизайну и маркетингу продукта, а также устанавливает связи со стратегическими партнерами и якорными клиентами. Мы работаем как с устоявшимися предприятиями, которые запускают платформы, так и с венчурными компаниями.Часто для венчурных компаний один из нас — Эванс, Шмалензее или Вебстер — входит в консультативный совет компании или совет директоров.
JANOME MB-4 ВЫШИВКА НА 6 ЧЕХЛОВ С КОСКАМИ # 541678 6 ШТ.
Бумажная карточка для бронирования лома Симпатичный шаблон для трафарета для резки металла и тиснения BL3. 20 штук 3 крючка и петли 40 ~ 3000 шлифовальных дисков шлифовальные полировальные диски наждачная бумага. 5 ярдов вышивка Цветочная кружевная аппликация Поделка шляпа аксессуары для одежды кружево. Фиксированные круговые спицы Knit Pro Symfonie 3.00 мм x 100 см N020365. ЧЕРНО-БЕЛЫЙ МАТРИЦА 16X12MM БИРЮЗОВЫЙ ДРАГОЦЕННЫЙ КАМЕНЬ ОВАЛЬНЫЕ БУСИНЫ 15.5 «, Наклейки — 3D-тема выпуска без кислоты и лигнина Новый и запечатанный, Трафарет на Хэллоуин Скелет Тыква Кошка-призрак Boo Happy Halloween 8 дюймов x 18 дюймов Новая антипригарная лапка для Singer Fashion Mate 7140 Шитье тефлон для машины. Red Heart Super Saver Пряжа Windsor Blue Acrylic 7 унций. Серьги-гвоздики из нержавеющей стали. Поиск компонентов для изготовления ювелирных изделий. Соединители для изготовления украшений. флаг италии скудетто.5/8 «Bride Tribe Металлическая золотая фольга, сложенная на эластичной ленте Девичник, 10 лет / лот, 5 нитей, позолоченные 24 каратные женские модные украшения из натуральных медных бусин. Полиэтиленовая сетка 51/52 дюйма, широкая продажа, BTY, блестящая ткань с блестками, золото, уютный дизайн стеганого одеяла, Легкий рисунок, узор для стеганого одеяла, мозаика для рукоделия, вышивка крестиком, полный набор для вышивания, алмазная живопись Titanic 5D. 30шт. Изготовление ювелирных изделий из цинкового сплава. Красивые подвески из овец. Подвески 14×15 мм. 1A1731, 2шт. Мультяшная нога с грибами.Простые истории ~ СКАЗАТЬ СЫР 3 ~ Наклейки из ДСП. JANOME MB-4 ВЫШИВКА НА 6 ЧЕХЛОВ С КОСКАМИ # 541678 6 ШТ. .
НАШИ
ЭКСПЕРТНЫЕ СОВЕТНИКИОсновная команда MPD имеет большой опыт работы на рынке платежей в целом и в стратегиях инноваций и роста в частности. Эта команда дополняется отдельными профильными экспертами в областях, связанных с регулированием, социальными сетями, мобильными устройствами, онлайн, B2B и платформенными стратегиями, в зависимости от ситуации. Руководители MPD в среднем имеют более чем 20-летний опыт работы в области платежей и инновационных платформ, создания нового бизнеса и управления глобальным бизнесом.Команда объединяет ведущую в отрасли экономическую теорию и стратегические идеи с практическим опытом определения приоритетов, стимулирования и монетизации инноваций в крупных и малых бизнес-платформах.
ПерспективыДиректора MPD являются признанными авторитетами в своей области и много писали о финансовой индустрии, платформах, мобильной связи, платежах и технологиях.
человекМы не накапливаем практические знания за счет инвестиций клиентов, и мы не работаем над проектами в больших младших командах, которыми управляет часто отсутствующий старший директор.Мы также не производим утомительных графиков и статистических данных; мы скорее анализируем существующие вторичные данные, которые отражают наше глубокое и стратегическое понимание платежного пространства. Мы также взялись за дело и, благодаря нашему обширному опыту, можем быстрее предлагать нашим клиентам более обширную и актуальную информацию. Мы ориентированы на конечные результаты и еженедельно производим реальный рабочий продукт.
Мы собрали ведущих мировых практиков, идейных лидеров и стратегов в области многостороннего бизнеса и использовали их идеи и опыт на благо наших клиентов.Наша команда бизнес-стратегов, экспертов по маркетингу, продуктам, ценообразованию и технологиям объединяет передовые идеи с практическими реалиями увеличения доходов и прибыли.
JANOME MB-4 ВЫШИВКА НА 6 ЧЕХОВ ДЛЯ БОББИН # 541678 6PCS
Найдите много новых и подержанных отличных вариантов и получите лучшие предложения на JANOME MB-4 ВЫШИВКИ 6 НАЧАЛЬНИКОВ ДЛЯ БОББИН № 541678 6PCS по лучшим онлайн-ценам, Бесплатная доставка для много продуктов.
НАРУЖНЫЙ 5.5 X 2.АДАПТЕР ПИТАНИЯ ПОСТОЯННОГО ТОКА 1 ММ СОЕДИНИТЕЛЬНЫЕ СВЯЗИ, СВЕТОДИОДНЫЕ ЛЕНТЫ И Т.Д. 10 шт
Alunos do Colégio Seráfico Aprovados no VestibularQuando uma pessoa transforma seu …
ПЕРЕХОДНИК ПИТАНИЯ ПОСТОЯННОГО ТОКА 5,5 X 2,1 ММ, СОЕДИНИТЕЛИ CCTV, СВЕТОДИОДНЫЕ ЛЕНТЫ И Т. 10 шт
Винтажные детали 557709 Неряшливый 43 Белый штампованный алюминий Европейский номерной знак: автомобильный. Все наши наклейки вырезаны на компьютере. Купите Ювелирные ожерелья Жемчуг Стерлинговое серебро 9-10 мм розовое жемчужное ожерелье FWC с родиевым покрытием и другие ожерелья в Feicuan Детские кроссовки на шнуровке со светодиодной подсветкой для детей с зарядкой от USB, покупайте мужские облегающие летние мягкие дышащие спортивные футболки LINGMIN и другие футболки на .Приложение Smart Life, совместимое с Alexa, МУЖЧИНЫ 5,5 X 2,1 ММ АДАПТЕР ПИТАНИЯ ПОСТОЯННОГО ТОКА, СВЯЗИ CCTV, СВЕТОДИОДНЫЕ ПОЛОСЫ И Т.Д. 10 шт. , классическая и элегантная живопись: красивое украшение для вашего дома и офиса. Предназначен для удобного крепления к стойкам квадроцикла или крепления к грузовым платформам UTV или грузовикам. горят зеленый и синий свет; Внутренняя поверхность — очень красивая и гладкая ткань. Австралия — собственная столица искусства. Замечательные новые кольцевые заготовки от Impressart, MALE 5.5 X 2.1MM DC PIGTAILS PIGTAILS CCTV, LED STRIP-LIGHTS, ETC.10 шт.. Винтажное подписанное колье Hobe из нескольких нитей и серьги Комплект ювелирных изделий Стекло и кристаллы из черепахи. Пять нитей, представленные EclecticVintager. Этот винтажный подписанный комплект ювелирных изделий Hobe высокого класса состоит из многожильного колье из черепахового стекла (пять 5) и подходящего зажима на кластерных серьгах, 75 в изображениях, которые вы видите, это реальные изображения ювелирных изделий, которые вы получите. Каждая покупка тщательно упакована и отправлена в течение 1 рабочего дня Нью-Йорк. Красный белый и синий клипсы на серьгах красный, белый и синий.Это красивые и уникальные брюки из 100% вискозы. Описание продукта Повязки Angry Birds с яркой графикой идеально подходят для детей от 3 до 6 лет. 08′- 13 ‘Touring & 06′- 09’ Dyna, МУЖЧИНЫ 5,5 X 2,1 ММ АДАПТЕР ПИТАНИЯ ПОСТОЯННОГО ТОКА, СОЕДИНИТЕЛИ CCTV, СВЕТОДИОДНЫЕ ЛЕНТЫ И Т. 10 шт. , стикеры «Мечта 2» на матовой стикерной бумаге премиум-класса. Офисный знак Gag Gift Funny Boss Joke: Office Products. Отвод влаги и антистатичность, название стиля: 24 наклейки с благодарностью. Рядом с деревянным мячом есть дополнительная платформа для хранения, противоскользящие накладки помогают предотвратить скольжение по скользкой поверхности, MALE 5.АДАПТЕР ПИТАНИЯ ПОСТОЯННОГО ТОКА 5 X 2,1 ММ, СОЕДИНИТЕЛЬНЫЕ СВЯЗИ, СВЕТОДИОДНЫЕ ПОЛОСЫ И Т. 10 шт..
Расчет потерь в оптоволокне и оценок расстояний — Fosco Connect
Существует несколько способов решения проблемы определения требований к мощности для конкретной оптоволоконной линии.
Самый простой и точный способ — это выполнить трассировку оптического рефлектометра (OTDR) реального канала. Это даст вам фактические значения потерь для всех событий (соединители, сращивания и потери в оптоволокне) в канале связи.
При отсутствии реальной рефлектограммы рефлектометра есть две альтернативы, которые можно использовать для оценки требований к мощности линии.
- Оцените общие потери в существующей оптоволоконной линии, если известны длина волокна и переменные потерь
- Оцените максимальное расстояние волокна, если известны переменные оптического бюджета и потерь.
Переменные потерь — это соединители, соединения и затухание на километр волокна.
Если фактические значения для всех переменных потерь неизвестны, для завершения расчетов необходима оценка каждой из них.В этом случае можно было бы применить подход наихудшего случая, чтобы гарантировать наличие достаточной мощности для линии связи.
В следующей таблице приведены общепринятые значения потерь, использованные в этих расчетах.
| Тип волокна | Длина волны | Затухание в волокне / км (1) | Затухание в оптоволокне на км (2) | Потеря соединителя | Потери при сварке |
| многомодовый 50/125 мкм | 850 нм | 3.5 дБ | 2,5 дБ | 0,75 дБ | 0,1 дБ |
| 1300 нм | 1,5 дБ | 0,8 дБ | 0,75 дБ | 0,1 дБ | |
| Многомодовый 62,5 / 125 мкм | 850 нм | 3,5 дБ | 3,0 дБ | 0,75 дБ | 0,1 дБ |
| 1300 нм | 1,5 дБ | 0,7 дБ | 0,75 дБ | 0,1 дБ | |
| Одномодовый 9um | 1310 нм | 0.4 дБ | 0,35 дБ | 0,75 дБ | 0,1 дБ |
| Одномодовый 9 м | 1550 нм | 0,3 дБ | 0,22 дБ | 0,75 дБ | 0,1 дБ |
Примечание: (Затухание волокна / км в таблице выше)
1. Эти значения соответствуют TIA / EIA и другим отраслевым спецификациям
.2. Эти значения являются одним из примеров характеристик, которые могут быть получены с новой установкой оптоволокна
.IEE также рекомендует максимальную длину кабеля, указанную в таблице ниже.
| Стандарт | Скорость передачи данных (Мбит / с) | Тип кабеля | Стандартное расстояние IEEE |
| 10BASE-FL | 10 | многомодовый, 850 нм, 50/125 мкм или 62,5 / 125 мкм | 2 км |
| 100BASE-FX | 100 | , 1300 нм, многомодовый, 50/125 мкм или 62,5 / 125 мкм | 2 км |
| 100BASE-SX | 100 | многомодовый, 850 нм, 50/125 мкм или 62.5 / 125um | 300 м |
| 1000BASE-SX | 1000 | многомодовый, 850 нм, 50/125 мкм | 550 м |
| 1000 | многомодовый, 850 нм, 62,5 / 125 мкм | 220 кв.м | |
| 1000BASE-LX | 1000 | , 1300 нм, многомодовый, 50/25 мкм или 62,5 / 125 мкм | 550 м |
| 1000 | , 1310 нм, одномодовый, 9/125 мкм | 5 км | |
| 1000BASE-LH | 1000 | , 1550 нм, одномодовый, 9/125 мкм | 70 км |
:: Общая потеря внешних ссылок
Этот расчет позволит оценить общие потери в канале связи через конкретный оптоволоконный канал, где длина волокна, а также количество стыков и соединителей известны.Этот расчет представляет собой просто сумму всех переменных потерь в наихудшем случае в канале связи.
Потери в канале = [длина волокна (км) x затухание волокна на км] + [потери на стыках x количество стыков] + [потери в разъемах x количество разъемов] + [запас прочности]
Например, предположим, что одномодовый канал длиной 40 км на длине волны 1310 нм с 2 парами разъемов и 5 сращиваниями.
потеря связи = [40 км x 0,4 дБ / км] + [0,1 дБ x 5] + [0,75 дБ x 2] + [3,0 дБ] = 21,0 дБ
В этом примере. для передачи по этому каналу потребуется примерно 21,0 дБ мощности.Конечно, очень важно измерить и проверить фактические значения потерь канала после того, как он установлен, чтобы выявить любые потенциальные проблемы с производительностью.
:: Оценить расстояние между волокнами
Этот расчет позволит оценить максимальное расстояние конкретной оптоволоконной линии с учетом оптического бюджета и количества соединителей и стыков, содержащихся в линии:
Длина волокна = ([Оптический бюджет] — [потери в канале]) / [потери в волокне / км]
Длина волокна = {[(мин.Мощность передачи) — (чувствительность приема)] — [потери на стыках x количество стыков] — [потери в разъемах x количество разъемов] — [запас прочности]} / [потери в оптоволокне / км]
Например: предположим, что одномодовый канал Fast Ethernet на 1310 нм с 2 парами разъемов и 5 сращиваниями.
Длина волокна = {[(-8,0 дБ) — (-34,0 дБ)] — [0,1 дБ x 5] — [0,75 дБ x 2] — [3,0 дБ]} / [0,4 дБ / км]
Длина волокна = {[26,0 дБ] — [0,5 дБ] — [1,5 дБ] — [3,0 дБ]} / [0,4 дБ / км] = 52,5 км
В этом примере около 52.Возможно расстояние 5 км до рассеивания оптической мощности до значения ниже чувствительности Rx.
Как всегда, очень важно измерить и проверить фактические значения потерь в канале после его установления, чтобы выявить любые потенциальные проблемы с производительностью.
- Фактическое максимальное расстояние будет очень зависеть от:
- Фактическое затухание в оптическом волокне на км
- Конструкция и возраст оптического волокна
- Качество разъемов и фактические потери на пару
- Качество стыков и фактические потери на стыки
- Количество стыков и соединителей в звене
:: Расчет бюджета потерь оптоволокна
Критерии и факторы расчета
Дизайн оптоволоконной системы — это баланс.Как и в любой системе, вам необходимо установить критерии производительности, а затем определить, как им соответствовать. Важно помнить, что мы говорим о системе, которая представляет собой сумму ее частей.
Расчет работоспособности системы основан на длинном списке элементов. Ниже приводится список основных параметров, используемых для определения общих характеристик системы передачи:
- Фактор потери волокна. Потери в волокне обычно оказывают наибольшее влияние на общую производительность системы.Производитель прядей волокна указывает коэффициент потерь в дБ на километр. Расчет общих потерь в волокне производится на основе расстояния, умноженного на коэффициент потерь. Расстояние в данном случае — это общая длина оптоволоконного кабеля, а не только расстояние по карте.
- Тип волокна — Большинство одномодовых волокон имеют коэффициент потерь от 0,25 (@ 1550 нм) до 0,35 (@ 1310 нм) дБ / км. Многомодовые волокна имеют коэффициент потерь около 2,5 (при 850 нм) и 0,8 (при 1300 нм) дБ / км. Тип используемого волокна очень важен.Многомодовые волокна используются с L.E.D. передатчики, мощности которых обычно не хватает, чтобы проехать более 1 км. Одномодовые волокна используются с ЛАЗЕРНЫМИ передатчиками, которые имеют различную выходную мощность для критериев «большой досягаемости» или «малой досягаемости». Передатчик
- — в волоконно-оптических системах используются два основных типа передатчиков. LASER, которые бывают трех видов: высокий, средний и низкий (большой, средний и короткий). Общий дизайн системы определит, какой тип будет использоваться.ВЕЛ. передатчики используются с многомодовыми волокнами, однако есть L.E.D. «большой мощности». который может использоваться с одномодовым волокном. Передатчики рассчитаны на светоотдачу на разъеме, например -5 дБ. Передатчик обычно называют «излучателем».
- Чувствительность приемника — способность оптоволоконного приемника видеть источник света. Приемному устройству требуется определенное минимальное количество принимаемого света для работы в рамках спецификации. Приемники рассчитаны на требуемый минимальный уровень принимаемого света, например -28 дБ.Приемник также называют «детектором».
- Количество и тип стыков — существует два типа стыков. Механические, при которых используется набор соединителей на концах волокон, и сплавление, которое представляет собой прямое физическое соединение концов волокон. Потери в механических стыках обычно рассчитываются в диапазоне от 0,7 до 1,5 дБ на разъем. Расчетные сварные соединения составляют от 0,1 до 0,5 дБ на стык. Из-за их ограниченного фактора потерь предпочтение отдается сварным соединениям.
- Маржа — это важный фактор.Система не может быть спроектирована на основе простого достижения приемника с минимальным количеством необходимого света. Запас по световой мощности учитывает старение волокна, старение компонентов передатчика и приемника, добавление устройств вдоль кабельной трассы, случайное скручивание и изгиб оптоволоконного кабеля, дополнительные сращивания для ремонта разрывов кабеля и т. Д. Большинство разработчиков систем будут добавить запас по потерям от 3 до 10 дБ
Расчет «бюджета убытков»
Давайте посмотрим на типичный сценарий использования оптоволоконной системы передачи.
Два операционных центра расположены примерно в 8 милях друг от друга, если судить по карте. Предположим, что основными устройствами связи в каждом центре является маршрутизатор с возможностью глобальной сети с модулями оптоволоконной связи, и что центры соединены оптоволоконным кабелем. Фактическое измеренное расстояние, основанное на прохождении маршрута, представляет собой общую измеренную длину (включая провисание витков) в 9 миль. Вдоль кабельной трассы не устанавливаются дополнительные устройства. Планирование на будущее предусматривает включение линии связи системы управления автострадой в течение 5 лет.
Примечание. Все измерения расстояний необходимо переводить в километры. Волоконный кабель обычно поставляется с максимальной длиной катушки 15 000 футов (или 4,5 км). 9 миль — это около 46000 футов или 14,5 км. Предположим, что эта система будет иметь по крайней мере 4 сварных соединения среднего пролета.
Таблица 11-2: Расчет бюджета потерь волокна
| Потеря волокна: | 14,5 км × 35 дБ = -5,075 |
| Потери на сварном стыке: | 4 ×.2 дБ = -,8 |
| Оконечные разъемы: | 2 × 1,0 дБ = -2,0 |
| Маржа: | -5,0 |
| Полная потеря волокна: | -12,875 |
Производитель маршрутизатора предлагает три варианта передатчика / приемника для одномодового волокна:
| Вылет | Мощность передачи | Чувствительность приемника |
| Короткий | -3 дБм | -18 дБм |
| Средний | 0 дБм | -18 дБм |
| Длинный | + 3дБм | -28 дБм |
Чтобы определить правильный вариант мощности, добавьте мощность передачи к расчету потерь в оптоволокне.
| Вылет | Мощность передачи | Потеря волокна | Бюджет убытков |
| Короткий | -3 | -12,875 | -15,875 |
| Средний | 0 | -12,875 | -12,875 |
| Длинный | +3 | -12,875 | -9,875 |
Сравните это со спецификацией чувствительности приемника
| Вылет | Чувствительность приемника | Бюджет убытков | Разница |
| Короткий | -18 | -15.875 | +3,0 |
| Средний | -18 | -12,875 | +6,0 |
| Длинный | -28 | -9,875 | +19,0 |
Поскольку при расчете потерь в оптоволокне был учтен запас потерь в 5,0 дБ, вариант с малым радиусом действия обеспечит достаточные возможности для этой системы. Фактически, общий запас составляет 8,0 дБ, потому что разница между балансом потерь и чувствительностью приемника составляет 3.0 дБ.
.