Экранирование от эстель отзывы: Экранирование волос Эстель Q3 THERAPY

Содержание

Estel Professional Q3 THERAPY Набор для процедуры экранирования блондированных волос

Основные характеристики
Средствонабор
Область примененияволосы
Тип волосдля всех типов
Текстуражидкая
Эффектпитание, облегчение расчесывания, придание эластичности, укрепление, придание блеска, увлажнение, устранение желтизны, придание мягкости, облегчение укладки, восстановление
Особенности примененияне требует смывания
Потребности волос и кожи головыдля окрашенных
Масла и экстрактыаргановое масло, комплекс масел
Профессиональное средствода
Состав1. Двухфазный спрей-кондиционер: aqua, isododecane, disiloxane, polyquaternium-16, cyclopentasiloxane, sodium pca, isopropyl alcohol, c12-15 alkyl benzoate, dimethiconol, argania spinosa kernel oil, camellia oleifera seed oil, citric acid, diazolidinyl urea, methylparaben, propylparaben, ethylhexyl methoxycinnamate, parfum, ci 607252.
Масло Q3 BLOND: isododecane, cyclopentasiloxane, dimethiconol, disiloxane,c13-16 isoparaffin (and) dimethicone (and) c10-13 isoparaffin, argania spinose kernel oil, persea gratissima (avocado) oil, juglans regia (walnut) oil, camellia oleifera seed oil, tocopheryl acetate, parfum, ethylhexyl methoxycinnamate, Cl 607253. Масло-блеск Q3 для всех типов волос: isododecane, disiloxane, cyclopentasiloxane, c12-15 alkyl benzoate, argania spinosa kernel oil, macadamia ternifolia seed oil, parfum, limonene, linalool, butylphenyl methylpropional, citronellol, geraniol, ethylhexyl methoxycinnamate
Способ применениямасло Estel Professional Q3 следует наносить на слегка увлажненные пряди и не смывать водой
Дополнительная информацияв состав набора входят двухфазный спрей-кондиционер Q3 BLOND для блондированных волос, масло Q3 BLOND для блондированных волос, масло-блеск Q3 LUXUARY для всех типов волос; масло Q3 BLOND не содержит искусственных консервантов и парабенов; масло Q3 BLOND содержит витамин Е, масло-блеск Q3 не содержит искусственных красителей, консервантов и парабенов

Экранирование волос Estel Q3 и загуститель волос от 160 000 руб.

- Скидка предоставляется только при наличии промокода.

- Поставщик несет полную ответственность перед потребителем за достоверность информации.

 


Эти микроскопические волокна волос опираются на существующие волосы. Они производят плотность и объем волос вашей головы в областях облысения. Применяя кератиновое средство восстановления структуры волос, вы просто удерживая контейнер над истончение области, и слегка встряхиваете его, и в течение нескольких секунд тысячи цветовых соответствующих волокон переплетаются с существующими волосами давая вам выглядеть и чувствовать себя с более объемными и пышными волосами.

Когда вы посыпаете FULLY hair building fibers в область редких волос, волокна автоматически цепляются к вашим волосам, т.к. волокна этого средства несут отрицательный электрический заряд, а человеческих волос заряжен положительно.

Результатом является склеивание через естественные электромагнитные силы. Каждый тонкий пучок волос мгновенно становится толще и полнее, устраняя те смущающие области редких волос. Нет больше блестящей кожи головы, где должны быть только волосы.

Волокна FULLY не являются синтетическими, искусственными волокнами, приготовленными в лаборатории. Структура этих волокон любезно позаимствована у самой матери-природы, благодаря чему, она так точно имитирует структуру человеческого волоса.
Основным компонентом в составе FULLY являются микроволокна растения под названием Марокканский Травянистый Хлопок (Gossypium Herbaceum Maroccanum). Это разновиднсть хлопка, произрастающая исключительно в засушливых регионах Марокко.

Волокна Марокканского хлопка имеют особенное внутреннее строение, а также несут в себе отрицательный электрический заряд, в то время как человеческий волос заряжен положительно. При соприкосновении FULLY с волосами, происходит склеивание микроволокон под воздействием естественных электромагнитных сил, при этом, никаких дополнительных склеивающих составов наносить не требуется.

 

Инструкция по использованию:

1) Вымойте волосы хорошо, убедитесь, что они сухие перед использованием.
2) Откройте банку, наклоните ее вниз на 45 градусов, встряхните над облысевшей областью, пока область не будет полностью покрыта.
3) Аккуратно погладить волосы, чтобы волокна равномерно присоединились к волосам. Не расчесывать волосы, т.к. это что окажет влияние на электростатическую абсорбацию.
4) В течении 30 секунд волокна полностью присоединяться к волосам! После этого, слегка распрыскать лаком на волосы для лучшего эффекта.

 

Одной баночки загустителя волос FULLY 23г хватает на 3-4 месяца

каждодневного использования.

 

Экранирование волос Эстель Q3 THERAPY

Здравствуйте! В этом отзыве я хочу предостеречь тех, кто хочет себе сделать экранирование волос в надежде на то, что эффект будет хорошим и продолжительным:) На эту процедуру я попала случайно: По окончании отдыха на море волосы прибыли к себе не в очень хорошем состоянии и я не могла ожидать ни дня, мне без всяких отлагательств необходимо было подравнять и подлечить их. Исходя из этого не так продолжительно осталось ожидать рванула в парикмахерскую рядом с домом. Трудится она лишь на продукции Estel, исходя из этого выбора мне не предоставили: из уходовых одолжений было только экранирование волос. Цена (в моем салоне): Продолжительные волосы – 600 руб Средние волосы – 500 руб Маленькие волосы – 400 руб Целиком и полностью доступно. А в рекламной брошюрке так грубо говоря, описание, ничем не уступающее по обещаниям ламинированию: и блестящую пленочку около волоса формирует, и числом прическу увеличивает на 10%, влагу сохраняет, витаминами волосы питает, к тому же и эффект длится до 2 недель.

Красота! – как происходит процесс экранирования волос – Сам процесс похож на процедуру “СЧАСТЬЕ ДЛЯ ВОЛОС”, за счет того, что средства наносятся послойно и ничего не смывается: 1. Моют голову шампунем по типу волос 2. Двухфазным голубеньким кондиционером (для увлажнения и придания гладкости волосам) распыляют на всю длину волос. Не смывают. 3. Желтое силиконистое масло (для восстановления структуры волос) растирают в ладонях, наносят на нижнюю половину волос. Не смывают 4. Прозрачный спрей- масло (для защиты волос и придания блеска) легко распыляют на волосы. Не смывают 5. Обрабатывают волосы утюжком (я пробовала отказаться, потому, что не обожаю это, но меня уверили, что тогда процедура не имеет смысла) 6. Повторно сбрызгивают волосы маслом из пункта 4. -СОСТАВ- Нигде в сети нет полного состава этих средств, к сожалению. Указывается только то, что они базируются на базе таких нужнейших масел, как масло арганы, масло макадамии, камелии и виноградных косточек. Но я таки раздобыла состав двухфазного кондиционера: Aqua, isododecane, disiloxane, polyqauartenium-16, cyclopentasiloxane, sodium на данный момент, isopropyl кожный покров, c2-15 Alkyl Benzoate, dimethiconol, Argania spinosa кожный покров oil, macadamia seed oil, citric acid, diazolidinyl urea, methylparaben, propylparaben, benzophenone-4, parfume, limonene, linalool, кожный покров, geraniol, Cl 42090 Все нужные масла-в финише по капельке.
В базе – силиконы. Пологаю, что и все остальные средства с подобными составами, потому, что результата, не считая силиконистого покрытия, я не увидела. -ЭФФЕКТ, ДО-ПОСЛЕ- Скажу сходу: не обольщайтесь результатами на фото, ниже поясню почему. Фото ДО. Волосы сломаны солнцем, морем, неподошедшим шампунем (они не засаленные, только вымыты) Фото По окончании Выглядит красиво. Но только выглядит, а не чувствуется. Эффект гладкости в основном из-за утюжка, что имеется наподобие как нужным. И по событию того, что одновременно были подстрижены кончики. А так- простое силиконистое покрытие. Каждые полирующие капельки дают такой же результат. Эффект держался только дни, на следующий дни волосы стали жирниться, по окончании первого же мытья головы все сошло на нет. Само собой разумеется, рекомендовать я это не могу. Мне не было нужно по нраву. За такие деньги вероятно купить настоящее МАСЛО АРГАНЫ или КОКОСОВОЕ МАСЛО и полечить им волосики. – Отзывы на другие салонные процедуры: ДЛЯ ЛИЦА 1. УЛЬТРАЗВУКОВАЯ ЧИСТКА ЛИЦА (фото ДО-ПОСЛЕ) 2.
Механическая чистка лица ДЛЯ ВОЛОС 1. Термострижка 2.Обжиг волос 3. Брондирование волос 4. Глазирование волос 5. Каутеризация волос 6. Ботокс для волос – семь дней 7. “Счастье для волос” Lebel ДЛЯ ТЕЛА и Похудения: 1. Солярий 2. Моментальный тропический загар 3. Вакуумный массаж банками 4. Спа-капсула для похудения 5. Душ шарко ДЛЯ НОГТЕЙ 1. Японский маникюр 2. Винилюкс, недельное покрытие 3. Гель-лак. Неточности при выполнении гель-лакового маникюра 4. Педикюр в салоне -Мой отзыв об уходе за волосами, что их в корне преобразил:)-

Доступ сейчас к Комиссии ЕС: уничтожьте беззубый Privacy Shield

ОБНОВЛЕНИЕ: 9 июля 2020 г. - 16 июля Суд Европейского Союза вынесет решение по делу «Шремс II». Хотя дело касается более крупных вопросов передачи данных между ЕС и США, оно может привести к аннулированию Privacy Shield. Access Now неоднократно призывал приостановить эту сделку, поскольку она не защищает права людей на конфиденциальность и защиту данных.

«Мы должны положить конец программе защиты конфиденциальности ЕС-США, - сказала Эстель Массе, руководитель отдела глобальной защиты данных Access Now . «Из года в год мы наблюдаем дебаты вокруг этого непродуманного и сильно ошибочного механизма, и мы надеемся, что Суд ООН придет к выводу, что Privacy Shield не работает в сочетании с европейскими и международными законами о правах человека».


18 сентября 2019 г. - Access Now призывает Европейскую комиссию отменить соглашение между ЕС и США «Privacy Shield» в свете неоднократного отказа администрации США предпринять необходимые шаги для защиты прав на неприкосновенность частной жизни в Европе.

Звонок поступил в соответствии с нашими обширными комментариями в Европейскую Комиссию по поводу третьего ежегодного обзора Privacy Shield, механизма, который позволяет передавать данные из Европейского Союза в Соединенные Штаты. В наших комментариях мы отмечаем события, которые ставят под сомнение обоснованность договоренности, включая усиление наблюдения США, которое свидетельствует о пренебрежении правами человека во всем мире. Эти изменения в сочетании с внутренними недостатками Privacy Shield, которые остаются без внимания, еще больше укрепляют позицию, согласно которой договоренность подрывает принципы защиты данных ЕС и должна быть устранена.

«Privacy Shield - это плохо подходящая структура, которая не гарантирует права людей на неприкосновенность частной жизни и защиту данных и не соответствует законам ЕС», - сказала Эстель Массе, руководитель отдела глобальной защиты данных в Access Now . «Сохраняя Privacy Shield, Комиссия ЕС ослабляет европейскую систему защиты данных и рискует подорвать ее глобальную лидирующую роль в продвижении прав человека», - добавила она.

«Если правительство Соединенных Штатов не смогло защитить права на неприкосновенность частной жизни американского народа, как может ЕС ожидать, что США защитят цифровые права европейцев?» сказала Дженнифер Броуди, менеджер по законодательным вопросам в Access Now .«Администрация США не выполнила обязательства, взятые на себя в рамках Privacy Shield, и продолжает развертывать технологии наблюдения, нацеленные на лиц, не являющихся гражданами США. Договоренность должна быть отменена », - добавила она.

В нашем письме мы подчеркиваем, что зарождающиеся обсуждения федерального закона о конфиденциальности данных в США еще не должны убедить регулирующие органы ЕС и лица, принимающие решения, в том, что США выполнят свои обязательства по принятию всеобъемлющего закона. Фактически, становится все более очевидным, что Конгресс США, скорее всего, не примет надежный закон о защите данных до президентских выборов 2020 года в стране.

Подводя итог, несмотря на некоторые робкие попытки США, наконец, выполнить некоторые из своих обязательств в рамках Privacy Shield после более чем двух с половиной лет бездействия, законы и практика США продолжают подрывать права человека субъектов данных. в Европейском Союзе. Поэтому Еврокомиссии пора отменить это соглашение.

Полную версию заявки читайте здесь .

Access Now - международная неправительственная организация, занимающаяся вопросами прав человека и технической политикой по всему миру, включая офисы в Брюсселе и Вашингтоне, округ Колумбия. С.

ЧТОБЫ ЗАЩИТИТЬ КОРОЛЕВУ | Kirkus Обзоры

от J.A. Jance ‧ ДАТА ВЫПУСКА: 2 апреля 2019 г.

Список осужденных за убийство пяти человек, которых он хочет убить, охватывает диапазон от жены, которую он уже убил, до франшизы героини Али Рейнольдс.

В свое время женщины приезжали отовсюду, чтобы проконсультироваться у специалиста по репродуктивности Санта-Клариты доктора Эдварда Гилкриста. Многие из них оставили его заботу счастливой беременной, никогда не подозревая, что отцом детей, которых они вынашивали, был не кто иной, как сам врач, который пожертвовал свою собственную сперму, а не сперму красивых, атлетичных, здоровых мужчин, изображенных в его альбоме. Когда сын Александры Манси, Эван, умирает от болезни почек, которую он унаследовал от своего биологического отца, и она возвращается в Гилкрист в поисках медицинских записей донора, на него начинает падать крыша.К тому времени, когда оно закончилось, он отбывает пожизненное заключение в тюрьме Фолсом за заказное убийство своей жены, Дон, бывшей медсестры и когда-то донора яйцеклеток, которая напала на него. Ему нечего терять, и Гилкрист вытатуирует себя инициалами пяти человек, которых он обвиняет в своем падении: Рассвет; Лео Мануэль Аурелио, киллер, которого он нанял, чтобы избавиться от нее; Кейтлин Тодд, медсестра / регистратор, занявшая место Доун; Алекс Манси, чей поиск записей расстроил его тележку с яблоками; и Али Рейнольдс, тележурналист, который помог Алексу познакомиться с дюжиной других женщин, которые сформировали Progeny Project, потому что их дети выглядели так же, как ее. Неважно, что Али уже много лет не работает ни в Калифорнии, ни в новостном бизнесе; Гилкрист и его помощники знают, что месть нельзя подавать слишком холодно. Интересно, как далеко они продвинутся по этому списку, прежде чем Али при поддержке Фригг, методичного, но слабого ИИ, впервые представленного в Duel to the Death (2018), не бросится на них?

Умело, но в высшей степени предсказуемо. Среди всех временных сдвигов и встроенных предысторий самой удивительной особенностью является то, насколько мало ИИ с ограниченными возможностями, который попадает в дело более или менее непреднамеренно, отличается от вашего стандартного человека-помощника с проблемами.

Дата публикации: 2 апреля 2019 г.

ISBN: 978-1-5011-5101-9

Количество страниц: 352

Издатель: Gallery Books / Simon & Schuster

Обзор Опубликовано в сети: фев. 19, 2019

Обзоры Киркуса Выпуск: 1 марта 2019 г.

Поделитесь своим мнением об этой книге

Вам понравилась эта книга?

Апрель А.Эстель, MSN, FNP-C, ARNP

Апрель А. Эстель, MSN, FNP-C, ARNP | Spokane, WA

Вы используете устаревший браузер. Для оптимальной работы обновите браузер.

1386925949

4.9 163 Рейтинги | 65 комментариев

4.9 | 163 Рейтинги | 65 комментариев

Вы прикрыты?

Проверьте, принимает ли ваша страховка этот поставщик.
Обратитесь к своей страховой компании, чтобы подтвердить, принят ли ваш план медицинского страхования.

Закрыть страховой отдел Подсказка: Blue Cross Blue Shield HMO

Хорошие новости - вы застрахованы!

Об апрель А. Эстель

Эйприл Эстель - практикующая медсестра семейной медицины в Providence Medical Group Family Medicine Indian Trail.

Отзывы в сообществе

В Providence мы стремимся предоставить вам качественное и индивидуальное медицинское обслуживание. Мы постоянно стремимся оптимизировать ваш опыт.

Чтобы обеспечить вам положительный опыт работы с Providence, наш онлайн-каталог поставщиков услуг включает рейтинги и комментарии пациентов для избранных поставщиков. days}} {{/ days}} {{/ isActive}} {{#isActive}}

{{formattedDate}}

{{#days}} {{#visitTypes}} {{#timeSlots}} {{/ timeSlots }} {{/ visitTypes}} {{/ дней}} {{/ IsActive}} информация shieldInformation shieldInformation CircleInformation Круг IconSearchSearch IconCloseClose iconCheckCheckmarkEmpty HeartEmpty Сердце IconFull HeartFull Сердце IconPeoplePeople IconChatChat IconPhonePhone IconFaxFax IconLocationLocation IconCalendarCalendar IconDownMenu Переключить ArrowDownMenu Переключить ArrowTwitterTwitter IconFacebookFacebook IconYouTubeYouTube IconQuoteQuote SymbolHospitalHospital IconClinicClinic IconEarthEarth Машина Icon

: ampifyvm3; highPriority: false; fromSitemap: false; fromPortal: ложь;

Библиотеки мутантов обнаруживают негативный дизайн, защищающий белки от неправильной сборки и повторной локализации в клетках.

ВВЕДЕНИЕ

Понимание взаимосвязи генотипа и фенотипа имеет решающее значение для прогнозирования молекулярных последствий мутаций (1). На уровне белка сканирование аланина показало, как отдельные остатки вносят вклад в функцию белка, стабильность и сродство связывания (2–4). В последнее время систематические сопоставления широко используются для связи изменчивости последовательностей с изменениями в структуре белка (5, 6), стабильности (7–9), растворимости (10) и функциональности (2, 11–14). Сходные усилия были предприняты для картирования влияния мутаций на белок-лиганд (15, 16) и белок-белковые взаимодействия (17-21).

Однако мутации могут влиять на белки помимо их стабильности, функции или существующих взаимодействий с конкретными партнерами или лигандами.Последовательности также могут кодировать, как белки распределяются в пространстве в клетках, либо направляя их к мембраносвязанным компартментам (22), либо индуцируя их самосборку в большие повторяющиеся структуры (23-27) и безмембранные компартменты (28, 29). Хотя изменения в самосборке и локализации белка могут служить функциональной цели в адаптации (30–36), они также могут приводить к заболеванию (37). Например, неправильная сборка гемоглобина и γD-кристаллина вызывает серповидно-клеточную анемию и катаракту, соответственно (38, 39).Неправильная локализация ядерных белков TDP-43 и FUS в цитозоле связана с заболеванием БАС (40, 41), а неправильная локализация атаксина-3 в ядре связана с заболеванием SCA3 (42). Поэтому очень важно охарактеризовать принципы, с помощью которых мутации могут запускать такую ​​неправильную сборку и неправильную локализацию.

Симметрия часто встречается в белках (37, 43) и является критическим свойством, способствующим их самосборке в структуры высокого порядка (44-50). Действительно, сообщалось о сильном обогащении симметричными гомоолигомерами среди природных белков, образующих филаменты (37).Предыдущая работа также показала, что точечные мутации двух гидрофобных аминокислот - лейцина и тирозина - часто приводят к сборке симметричных гомоолигомеров в сборки высокого порядка. Однако, будут ли другие типы аминокислот проявлять подобный потенциал, будут ли они делать это часто и могут ли возникнуть дополнительные фенотипы сборки и локализации при мутации, остается неизвестным.

Здесь мы оцениваем потенциал мутаций вызывать такие изменения сборки и локализации белка in vivo .Мы нацелены на два гомоолигомерных белковых комплекса и случайным образом мутировали три соседних остатка на поверхности каждого комплекса. Мы экспрессировали мутанты, слитые с флуоресцентным белком, чтобы отслеживать их пространственное распределение в дрожжевых клетках. Мы обнаружили, что обширное пространство последовательностей приводит к изменениям в сборке и локализации белков в обоих белках с тремя преобладающими фенотипами: ядерная локализация, образование филаментов и образование точек. Секвенирование мутантов показало, что увеличение липкости поверхности часто способствует ядерной локализации в одном из двух белков.Удивительно, но в другом белке потеря отрицательно заряженных остатков была достаточной для запуска самосборки белка, при этом волокна часто формировались независимо от типа мутации, включая аланин и глицин. Мы также наблюдаем, что пять из десяти комплексов подвергаются неправильной сборке или изменению клеточной локализации, когда поверхностные заряды мутируют в аланин, подразумевая, что отрицательный дизайн против неправильной сборки и неправильной локализации является обычным среди симметричных гомоолигомеров.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Плазмидная библиотека поверхностных мутантов демонстрирует частые фенотипы самосборки и ядерной локализации. сделать так.Первоначально мы сосредоточились на гомооктамерной дипептидазе из

E. coli, в дальнейшем обозначаемой кодом PDB «1pok» (рис. 1A). Чтобы отслеживать самосборку и локализацию белка в клетках, мы слили субъединицу, образующую октамер, с желтым флуоресцентным белком (YFP, дополнительные сведения о конструкциях представлены в дополнительной таблице 1). Затем мы создали библиотеку плазмид путем мутагенеза с насыщением сайтов трех остатков, экспонированных растворителем (E239 / E243 / K247), расположенных в альфа-спирали (рис. 1A).Мы специально нацелены на эти остатки, потому что ранее наблюдалось, что тройной мутант лейцина в этих положениях формирует волокна. Мы трансформировали библиотеку плазмид в дрожжевых клетках и визуализировали их с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 1B). В то время как белок дикого типа демонстрировал гомогенную и цитозольную локализацию, мутанты часто образовывали микрометровые филаменты, точки или локализовались в ядре (рис. 1А и В).

Рисунок 1. Мутантная библиотека обнаруживает большое разнообразие фенотипов локализации.

А . Структура октамерного белкового комплекса из E. coli (код PDB 1POK). Экспрессия гомомера дикого типа, слитого с YFP, обнаруживает цитозольную локализацию. Б . Мы создали библиотеку плазмид со случайными мутациями в трех остатках, подверженных воздействию растворителя, расположенных на вершине 1pok, и трансформировали библиотеку в дрожжевые клетки. Показаны изображения флуоресцентной микроскопии клеток, экспрессирующих репрезентативные фенотипы. Идентичность мутаций для остатков 239/243/247 наложена на каждое изображение. C. Другая мутантная библиотека была создана с использованием кассеты для интеграции генома. Последующая трансформация библиотеки в дрожжевые клетки дала геномно интегрированные мутанты. Клетки, экспрессирующие мутанты, демонстрировали четыре основных фенотипа локализации с частотами, указанными на столбчатой ​​диаграмме. Ниже мы приводим изображения флуоресцентной микроскопии дрожжевых клеток, демонстрирующих восемь репрезентативных фенотипов. Мутации в остатках 239/243/247 наложены на каждое изображение. D. Частота аминокислот в каждой позиции (указана вверху), нормализованная по фенотипам.Аминокислоты, наблюдаемые у мутантов (ось y, слева), упорядочены по возрастанию склонности к взаимодействию или «липкости» (51). Сумма частот для данной мутации равна 1.

Затем мы с помощью ПЦР амплифицировали области, несущие мутации, для их секвенирования и соотнесения различных фенотипов с конкретными аминокислотными идентичностями. Однако секвенирование показало, что большинство клонов были ко-трансформантами до четырех различных плазмид. Следовательно, выделение клеток, несущих уникальную плазмиду, требовало нескольких этапов штриховки, что делало невозможным оценку частот различных фенотипов и соотнесение их с генотипами.Тем не менее, секвенирование двадцати изолированных мутантов показало, что филаменты и ядерная локализация были частым результатом увеличения гидрофобности поверхности белка (рис. 1B). Примечательно, что один мутант (F / W / E) показал фенотип с изогнутыми филаментами, растущими вдоль плазматической мембраны и ядерной оболочки.

Интегрированные в геном библиотеки мутантов позволяют количественно определять частоты фенотипов.

Чтобы преодолеть проблему совместной трансформации с несколькими плазмидами, мы создали новую библиотеку на основе кассеты, подходящей для интеграции генома.В этой библиотеке каждый трансформант нес уникальный набор мутаций. В соответствии с нашими первоначальными результатами, флуоресцентная микроскопия 220 изолированных мутантов выявила частое образование волокон и точек, а также ядерную локализацию (дополнительная таблица 2, монтаж 1). Секвенирование позволило нам связать фенотип каждого мутанта с лежащими в основе мутациями. После исключения штаммов, содержащих делеции, вставки и стоп-кодоны, мы получили 153 уникальных варианта, демонстрирующих четыре основных фенотипа (рис. 1C): 20.9% показали ядерную локализацию, 13,1% и 7,2% показали волокна и точки, соответственно, а 45,7% мутантов остались цитозольными, как последовательность дикого типа. Кроме того, 13,1% мутантов показали комбинацию фенотипов, такую ​​как цитозольная локализация с редким присутствием точек или комбинация как волокон, так и точек.

Затем мы исследовали, связаны ли определенные мутации с определенными фенотипами. Учитывая мутированное положение (например, E239), мы вычислили частоту встречаемости целевой аминокислоты (например, E239).g., мутация L) для каждого из четырех основных фенотипов, за исключением мутантов, показывающих смешанные фенотипы. Например, из 14 мутантов, несущих лейцин в положении E239, девять сформировали волокна, четыре сформировали точки, один был цитозольным и ни один из них не обнаружил ядерной локализации.

Таким образом, нормализованная частота лейцин-ассоциированных волокон в позиции E239 составляет 9/14 = 0,64. Эти нормированные частоты для четырех фенотипов показывают, что образование волокон преимущественно связано с мутацией L, W или Y в положении 239 (рис. 1D).Цитозольный фенотип был обогащен мутациями полярных аминокислот и ему способствовали мутации аминокислот с низкой склонностью к взаимодействию (то есть нелипкие аминокислоты, как определено ранее (51)). Интересно, что ядерная локализация, по-видимому, обусловлена ​​склонностью к взаимодействию, что согласуется с недавним отчетом (52). Наконец, образование точек не обнаруживает сильной ассоциации с конкретным набором аминокислот, за исключением большой доли мутаций в пролине, что указывает на то, что локальное развертывание альфа-спирали может частично объяснять этот фенотип (Рис. 1D).Таким образом, учитывая белок 1pok, мутации легко вызывали изменения в его локализации и фенотипах самосборки, и с этими изменениями были связаны физико-химические свойства мутированных остатков. Примечательно, что липкие аминокислоты способствуют как новой самосборке, так и ядерной локализации.

Чтобы оценить, могут ли мутации воспроизводимо индуцировать новые фенотипы сборки и локализации, мы нацелены на другой белок (рис. 2A): гомодекамерную кетопантоатметилтрансферазу из E.coli , в дальнейшем называемый идентификатором PDB 1m3u (рисунок 2B). Аналогичным образом мы создали библиотеку мутантов по трем остаткам, экспонированным для растворителя, расположенным в альфа-спирали. Мы выбрали 400 штаммов, из которых 237 несли уникальную последовательность без стоп-кодонов, вставок или делеций. Фенотипы мутантов попали в те же четыре основные группы: ошеломляющие 63,6% мутантов образуют волокна, 2,5% локализуются в ядре, 6,4% образуют точки, 9,7% демонстрируют смешанные локализации и только 17.Осталось 8% цитозоля (рис. 2B и C). Тепловая карта нормализованной частоты мутаций для этих четырех фенотипов показала иную картину, чем у 1pok: все типы аминокислот способствовали образованию волокон (рис. 2D). Точно так же группы цитозоля, точки и ядерной локализации не показали четкой ассоциации с конкретным классом аминокислот (рис. 2D).

Рисунок 2. E. coli Кетопантоаттрансфераза демонстрирует поразительную тенденцию к образованию волокон при мутации.

A. Мы создали YFP-слитую мутантную библиотеку 1m3u в кассете для интеграции генома и трансформировали ее в дрожжевые клетки. B. Структура декамерной кетопантоатметилтрансферазы из E. coli (код PDB 1M3U). Мутантная библиотека нацелена на три экспонированных растворителем остатка в альфа-спирали, расположенной на вершине комплекса. При экспрессии в дрожжевых клетках мутанты проявляли четыре основных фенотипа: цитозольный, ядерный, точечный и волокнистый, причем последний обнаруживается у> 60% мутантов. C. Изображения флуоресцентной микроскопии дрожжевых клеток, экспрессирующих восемь репрезентативных мутантов. Идентичность мутантных остатков в положениях 157/158/161 указана на каждом изображении. D. Тепловая карта, показывающая нормализованную частоту мутаций каждого типа аминокислот по четырем фенотипам.

В целом, обе мутантные библиотеки предполагают, что самосборка и ядерная локализация могут часто возникать в результате поверхностных мутаций в гомоолигомерах. Действительно, менее 50% случайных мутантов оставались цитозольными в обеих библиотеках.

Липкость и заряд являются основными детерминантами, регулирующими сборку белка и ядерную локализацию на уровне отдельных клеток

До сих пор мы видели, что мутации в обоих гомоолигомерах часто запускали их самосборку и ядерную локализацию. Однако взаимосвязь между физико-химическими изменениями, вызванными мутациями, и изменениями в сборке и локализации, оказалась различной для двух изученных белков, что побуждает к более количественному анализу этой взаимосвязи генотип-фенотип.Примечательно, что значительное количество штаммов показало неполную пенетрантность определенного фенотипа или даже смешанные фенотипы. Например, в то время как у некоторых штаммов волокна присутствовали в большинстве клеток, у других штаммов только небольшой процент клеток содержал волокна (рис. S1).

Чтобы зафиксировать эти фенотипические различия количественным образом, мы автоматически проанализировали свойства флуоресценции внутри отдельных клеток и отнесли каждую клетку к одной или нескольким из четырех возможных фенотипических категорий (рис. S2).Этот подход позволил нам рассчитать фракцию клеток, проявляющих определенный фенотип, то есть пенетрантность фенотипа, для каждого мутантного штамма. Распределение пенетрантности для каждого фенотипа показано на рисунке 3А. Мы наблюдаем, например, что волокна идентифицированы в 1,9%, 18,6% и 79,6% клеток для мутантов 1pok L / G / I, L / V / L и Y / G / L соответственно (для каждого триплета соответствующие положениям E239 / E243 / K247).

Рис. 3. Физико-химические свойства АК вызывают разные реакции в 1pok и 1m3u.

A Процент клеток данного мутанта 1pok и 1m3u, демонстрирующих волокна, точки, цитозольную и ядерную локализацию (фенотип пенетрантности). B Фенотип пенетрантности как функция суммарной предрасположенности к взаимодействию и чистого заряда мутированных аминокислот для 1pok и 1m3u. C Фенотипические изменения требуют повышенной липкости в случае 1pok, тогда как единственного удаления заряда, по-видимому, достаточно, чтобы вызвать фенотипические изменения в 1m3u, предполагая, что заряды представляют собой черту «негативного дизайна» в этом комплексе.

Мы проанализировали связь между пенетрантностью каждого фенотипа и двумя физико-химическими характеристиками мутировавших аминокислот: их суммарной склонностью к взаимодействию и их суммарным зарядом (Рисунки 3B и S3). Подтверждая наше первоначальное наблюдение, оба белка демонстрировали совершенно разные паттерны. С одной стороны, суммарная склонность триплета к взаимодействию была сильным предиктором цитозольной локализации в случае 1pok: мутанты 27 и 22 показали склонность к взаимодействию <0 или> 3, и среди них 99% и 46% клетки показали цитозольную локализацию, соответственно (p = 7e-6, t-критерий Велча).Напротив, учитывая, что мутанты 1m3u, 38 и 37 имеют показатель склонности к взаимодействию ниже 0 или выше 3, и они демонстрируют аналогичную долю клеток с цитозольной локализацией (36,6% и 49,8% соответственно, p = 0,17). С другой стороны, цитозольная локализация 1m3u была хорошо объяснена чистым зарядом мутаций: среди 28 и 62 мутантов с чистым зарядом <-1 или> +1 доля клеток, показывающих цитозольную локализацию, значительно различалась ( 73% и 21% соответственно, p = 9.7e-8). Напротив, чистый заряд не смог предсказать цитозольную локализацию для 1pok. Используя те же критерии заряда, мы находим 24 и 26 мутантов, среди которых цитозольная локализация встречается в 79% и 94% клеток, соответственно (p = 0,1).

Мы расширили этот корреляционный анализ, рассмотрев 20 дополнительных аминокислотных характеристик, включая склонность к образованию вторичной структуры, размер, гидрофобность и т. Д. (Рисунок S4, дополнительная таблица 4). Этот анализ подтвердил, что 1pok и 1m3u по-разному реагируют на конкретные физико-химические изменения.В то время как склонность к взаимодействию, гидрофобность и ароматичность остатков были основными свойствами, запускающими изменения в локализации и сборке 1pok, на 1m3u в первую очередь повлиял чистый заряд, как мы видели ранее. Мы провели частичный корреляционный анализ, чтобы определить независимый вклад этих свойств (Рисунок S5). Этот анализ также подтвердил картину, представленную выше, согласно которой липкость является основным детерминантом, связанным с пенетрантностью всех четырех фенотипов у 1pok.Напротив, чистый заряд мутаций был основным детерминантом в случае 1m3u.

В целом, эти результаты показывают, что склонность к взаимодействию и заряды являются центральными модуляторами самосборки и ядерной локализации в этих двух белках. Эти результаты также подчеркивают, что изменения таких свойств на поверхности белков могут вызывать различные реакции в симметричных белках. Для некоторых белков, таких как 1pok, фенотип самосборки может возникать как ответ на увеличение поверхностной гидрофобности или липкости, изменение, которое можно рассматривать как положительный дизайн в контексте взаимодействия белков.Для других белков, таких как 1m3u, нейтрализация поверхностных зарядов запускает новые фенотипы. Примечательно, что в этом контексте идентичность целевой аминокислоты не кажется особенно важной, указывая на то, что единственное удаление зарядов запускает новые фенотипы, особенно в данном случае самосборку в волокна. Это наблюдение указывает на то, что заряженные остатки на поверхности 1m3u действуют как элементы «негативного дизайна» (рис. 3C), которые мы исследуем далее.

Заряженные остатки привратника защищают от неконтролируемой сборки и повторной локализации in vivo

Десольватация гидрофобных остатков, которая сопровождает их захоронение на границах раздела белков, является энергетически выгодным (53). По этой причине ожидается, что мутации гидрофобных аминокислот с большей вероятностью будут запускать новые сайты взаимодействия, чем мутации гидрофильных. Например, при серповидно-клеточной анемии заряженная и полярная глутаминовая кислота мутирует в гидрофобный валин в бета-цепи гемоглобина, вызывая его сборку в филаменты (38). Эта идея согласуется с мутантной библиотекой 1pok, посредством чего самосборка связана с позитивным дизайном в форме гидрофобной аминокислоты в положении 239.Напротив, самосборка 1m3u в волокна и точки происходила не только в ответ на мутации в отношении гидрофобных остатков, но также с полярными и заряженными остатками. Например, мутанты N / S / S, T / D / R и R / Q / T (в положениях D157 / D158 / D161) состояли исключительно из полярных остатков и были среди вариантов, образующих волокна (дополнительная таблица 2). Эти мутанты предполагают, что одного удаления отрицательно заряженных остатков достаточно, чтобы создать новое самовзаимодействие и вызвать самосборку 1m3u в волокна. Эта идея напоминает негативный дизайн (54-59), где привратные остатки предотвращают сворачивание белков в ненативные конформации (60, 61) и участие в ненативных взаимодействиях (54). Действительно, удаление элементов негативного дизайна может способствовать межмолекулярным контактам и кристаллизации белка (62).

Чтобы проверить, достаточно ли отключения отрицательно заряженных остатков для запуска новых самовзаимодействий, мы создали специфические тройные мутанты по аланину. Интересно, что мутации привели к образованию волокон и точек в 1 м3, тогда как 1pok оставался растворимым (рис. 4А).Мы наблюдали аналогичный результат при изучении эффекта тройных мутантов глицина 1pok и 1m3u, которые существовали в мутантных библиотеках (дополнительная таблица 2). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что самосборка 1pok в волокна требует положительного дизайна, тогда как удаления зарядов на поверхности 1m3u достаточно, чтобы запустить его сборку в волокна.

Рис. 4. Отрицательный дизайн против самосборки обычен для симметричных белков.

A. Изображения флуоресцентной микроскопии дрожжевых клеток, экспрессирующих мутанты дикого типа и аланина в 1pok и 1m3u. B. Изображения флуоресцентной микроскопии дрожжевых клеток, экспрессирующих восемь дополнительных симметричных комплексов и их мутантные варианты аланина. Процент клеток с нецитозольным фенотипом для каждого штамма наложен на изображение.

Для дальнейшего исследования этой идеи мы создали мутанты аланина для восьми дополнительных гомомеров, которые мы называем их кодом PDB (рис. 4B, дополнительная таблица 3). Мы ввели от двух до четырех мутаций в положения, которые, как было ранее показано, запускают образование волокон при мутации лейцина или тирозина (44).Мутации аланина увеличивали пенетрантность нецитозольных фенотипов в семи из восьми комплексов. Запуск более частых точек в 1l6w, 1frw, 1yac, 2wcv, волокон в 2vyc и ядерной локализации в 1d7a и 2cg4 (Рисунок 4B). Таким образом, единственная нейтрализация поверхностных зарядов может сама по себе часто запускать новые сборки белка и изменять субклеточную локализацию белка.

ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Здесь мы демонстрируем, что мутации на поверхности двух симметричных комплексов часто запускают их самосборку в точки и волокна, а также изменения в их субклеточной локализации.Кроме того, мы сообщаем о двух различных мутационных путях, управляющих этими изменениями: один связан с мутациями, увеличивающими липкость поверхности, а другой - с единственным удалением поверхностных зарядов. Таким образом, в то время как первый путь основан на позитивном дизайне, второй включает нейтрализацию негативных элементов дизайна. Этот результат побудил нас проанализировать восемь дополнительных симметричных комплексов и спросить, может ли мутация поверхностных зарядов на аланин достаточна для запуска новых фенотипов сборки и локализации. Мы обнаружили такие изменения в девяти из десяти исследованных белковых комплексов, а для пяти изменения были статистически значимыми.Это наблюдение экспериментально подтверждает, что среди симметричных белковых комплексов часто встречается отрицательный дизайн.

В этой работе мы сосредоточились на эффекте мутаций на участках, расположенных на вершине четвертичной структуры (рис. 4). В предыдущей работе мы предсказали, что эти области подвержены негативному дизайну (44, 49), и здесь мы экспериментально подтвердили это предсказание. Дальнейшая работа будет необходима, чтобы определить, часто ли мутации в других частях структуры (т.е. дальше от «вершины») вызывают изменения в сборке белка и фенотипах субклеточной локализации.

Два наблюдаемых нами мутационных пути также встречаются среди естественных белковых ансамблей. Действительно, многочисленные белковые волокна стабилизируются взаимодействием определенных аминокислот, которые обычно являются гидрофобными или ароматическими. Например, мутация глутаминовой кислоты в валин заставляет гемоглобин образовывать филаменты и приводит к серповидно-клеточной анемии (38). В другом примере полимеризация дрожжевой гексокиназы в филаменты происходит, когда тирозин вставляется в гидрофобный карман из-за конформационного изменения, запускаемого лигандом (30). Подобные взаимодействия ответственны за образование филаментов IMPDH человека (63), E. coli и CTPS человека (64), а также за лекарственную полимеризацию онкогенного фактора транскрипции BCL6 (65).

Интересно, что увеличение склонности к самосборке, наблюдаемое в покоящихся клетках, связано с изменениями pH (34, 66) и может напоминать принцип отрицательного дизайна, наблюдаемый в этой работе. Действительно, снижение pH может нейтрализовать поверхностные заряды и разблокировать сайты загадочного взаимодействия, способствуя самосборке в этих условиях.Интересно, что окислительное повреждение, связанное со стареющими клетками, способствует агрегации за счет нейтрализации заряда (67), и аналогичный механизм может запускать сборку белка. Будущие эксперименты, нацеленные на картирование взаимосвязи между последовательностью и сборкой в ​​различных условиях роста или при разных значениях pH, помогут выделить детерминанты последовательности для такой зависимой от состояния сборки белка.

Поразительное количество мутантов библиотек 1pok и 1m3u и некоторые из мутантов аланина двух дополнительных комплексов (1d7a и 2cg4) обнаруживают ядерную локализацию.Комплекс ядерных пор (NPC) имеет диффузионный барьер, состоящий из внутренне неупорядоченных белков, богатых фенилаланином и глицином (домены FG). Он действует как молекулярное сито с пределом размера пассивной диффузии около 40 кДа. Макромолекулы большего размера не могут эффективно пересекать диффузионный барьер и должны проходить через ядерные переносчики (68). Все белковые комплексы, использованные в этой работе, значительно превышают предел пассивной диффузии (дополнительные таблицы 1 и 3). В частности, 1m3u и 1pok имеют молекулярную массу в диапазоне 280 кДа и 320 кДа соответственно.Поскольку у них отсутствует сигнал NLS, они не должны распознаваться ядерными переносчиками и, следовательно, должны быть исключены из ядра. Однако, в соответствии с предыдущими сообщениями (52, 69), мы обнаружили, что гидрофобность поверхности способствует ядерной локализации 1pok, несмотря на его большой размер. В то же время ядерная локализация 1m3u вызвана не увеличением липкости поверхности, а положительными зарядами. Интересно, что тот факт, что мутации, способствующие ядерной локализации, относятся к разным типам для обоих комплексов и способствуют их соответственной самосборке в волокнах и точках, указывает на то, что ядерная локализация, которую мы наблюдаем, связана с образованием сборок высокого порядка.Нарушение регуляции нуклео-цитоплазматической локализации связано с нейродегенеративными расстройствами, а также с раком (70). Наши результаты предполагают, что такое нарушение регуляции локализации может происходить неканоническими путями, которые необходимо будет охарактеризовать в будущей работе.

Эта работа открывает путь к пониманию того, как изменения химического состава поверхности белка могут влиять на его пространственное распределение в клетке, модулируя его состояние самосборки и нуклео-цитоплазматическую локализацию. Удивительно широкое пространство последовательностей привело к изменениям сборки и локализации в двух изученных нами белках, и в будущем потребуются исследования, чтобы обобщить эти наблюдения на другие белки. В этом отношении тот факт, что белки мало растворимы (71), означает, что мы можем ожидать, что такие изменения сборки и локализации будут обычными. Сделанные нами наблюдения также имеют значение с точки зрения функции и эволюции протеома. Хотя считается, что локализация белка регулируется линейными мотивами, изменения в химии поверхности белка могут приводить к таким изменениям в процессе эволюции, как в здоровье, так и в болезни.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выбор белков

Гомоолигомеры, использованные в данной работе, были отобраны на основе определенных критериев, описанных ранее (44).Подробная информация об их структуре, названиях генов, номерах доступа PDB, количестве субъединиц, симметрии, теоретической изоэлектрической точке и количестве положительных и отрицательных зарядов приведены в дополнительных таблицах 1 и 3.

Процедуры клонирования, мутагенез и создание библиотек генов

Гены, кодирующие десять диэдральных гомомеров, используемых в данной работе, были амплифицированы из штамма E. coli K12 и клонированы, как описано ранее (44). Кроме того, гены, кодирующие структуры 1POK и 1M3U, были клонированы ниже дрожжевого промотора GPD в плазмиды M3925 для интеграции в геном (72).Молекулярное клонирование проводили методом PIPE (73). Десять гомомеров были слиты с YFP (Venus) (74), разделенным гибким линкером (последовательность: GGGGSGGGGS), для отслеживания их локализации in vivo . Для введения мутаций аланина десять гомомеров подвергали сайт-направленному мутагенезу (QuickChange, Agilent). Библиотека эписомальных генов 1pok была основана на плазмиде p413 GPD. Геномно интегрированные мутантные библиотеки были основаны на плазмиде M3925 GPD (trp1 :: KanMX3). Мутагенез с насыщением сайтов целевых остатков (дополнительная таблица 1) был достигнут с использованием олигонуклеотидов с рандомизированными основаниями в кодонах, нацеленных на мутагенез.Все остатки, нацеленные на мутагенез, подвергались воздействию растворителя с доступной площадью поверхности> 25%. Олигонуклеотиды, используемые для клонирования, мутагенеза и конструирования мутантных библиотек, были заказаны в IDT.

Разрешение множественных векторных трансформантов

Секвенирование дрожжевых колоний после трансформации библиотеки генов 1pok на основе плазмиды p413 показало, что большинство из них несли до четырех различных плазмид. Для разделения отдельных последовательностей отдельные колонии разбавляли PBS и наносили штрихами на чашки с агаром с синтетической полной средой без гистидина (SC-His).Эту процедуру разведения штрихов повторяли три раза для каждого мутанта перед их секвенированием.

Штаммы дрожжей и среды

Исходным штаммом дрожжей, использованным в этой работе, был BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0). Плазмиды p413, кодирующие белки дикого типа, мутанты аланина и библиотеку генов 1pok, трансформировали в клетки BY4741 с использованием метода LiAc, как описано (75). Трансформанты выращивали в чашках с агаром SC-His и инокулировали в 384-луночные планшеты, содержащие SC-His с 15% глицерином, и хранили при -80 ° C после выращивания до насыщения. Для библиотек генов 1pok и 1m3u на основе плазмиды M3925 кассету для геномной интеграции амплифицировали в виде линейного фрагмента перед ее трансформацией в дрожжевые клетки. Трансформанты выращивали в чашках с агаром SC + G418 (300 мкг / мл), а также инокулировали в 384-луночные планшеты, выращивали в 15% глицерине SC + G418 (200 мкг / мл) и хранили при -80 ° C.

Микроскопический скрининг и подготовка образцов

Робот для обработки жидкости (Tecan Evo 200) использовался для выполнения переноса клеток с планшета на планшет с помощью пинструмента (контакты FP1, V&P Scientific).Клетки инокулировали из запасов глицерина в 384-луночные полипропиленовые планшеты, содержащие SC-His (для штаммов, содержащих плазмиды p413) или SC + G418 (200 мкг / мл) (для штаммов интегрированных в геном библиотек генов), и выращивали до достижения насыщения. . Затем клетки из насыщенных культур инокулировали в 384-луночные планшеты для визуализации со стеклянным дном Greiner ™, содержащие подходящую среду для отбора для каждого случая. Клетки выращивали не менее 6 часов, пока они не достигли логарифмического роста (оптическая плотность ~ 0.5-1). Визуализацию выполняли с использованием автоматического микроскопа Olympus X83, соединенного с конфокальным сканером с вращающимся диском (Yokogawa W1) с масляным иммерсионным объективом 60x, 1,35 NA (UPLSAPO 60XO, Olympus). Возбуждение флуоресценции достигалось с помощью лазера 488 нм (Toptica, 100 мВт), комплекты эмиссионных фильтров (525/28, Chroma). Мы записали 16-битные изображения для каналов светлого поля и GFP на камеру Hamamatsu Flash 4 V2. Аппаратный автофокус (система компенсации Z-дрейфа Olympus) использовался для поддержания фокуса во время экспериментов по визуализации.

Анализ изображений

Клетки были идентифицированы, сегментированы, и их флуоресцентный сигнал (медиана, среднее, минимальное, максимальное), а также дополнительные свойства клеток были определены с использованием пользовательских алгоритмов (76, 77) в FIJI (78) и экспортированы в виде таблицы файлы.

Автоматическое определение фенотипов клеток

Волокна, точки и ядерная локализация были идентифицированы в каждой клетке независимо, в многоэтапном процессе: (i) Мы рассчитали максимальную и среднюю интенсивность флуоресценции пикселей в данной клетке.(ii) Клетки, максимальная интенсивность которых была ниже 200, или клетки, не содержащие заметно яркой области (максимум / медиана <2,5), были отнесены к цитозольным. (iii) Мы определили самые большие четыре области, состоящие из пикселей с интенсивностью в 2,5 раза выше средней интенсивности ячейки. Если такие области интереса (ROI) существовали, имели округлость выше 0,4 и область выше 4 пикселей, клетке был присвоен один или несколько нецитозольных фенотипов (волокна, ядерные или точки) на основе критериев флуоресценции ROI и форма, как описано в дереве решений (рисунок S2B).В этих ячейках для каждой найденной области интереса (до четвертой по величине) этой области был присвоен фенотип. Наконец, фенотип клетки был определен как объединение фенотипов всех областей интереса. Эта процедура была оптимизирована на основе набора данных из 1834 ячеек, который мы аннотировали вручную.

Анализ данных

20 числовых шкал, представляющих физико-химические и биохимические свойства АК (дополнительная таблица 4), были выбраны из (http://www.genome.jp/aaindex/), за исключением шкал склонностей к взаимодействию, взятых из (79) и (Villegas J et al. рукопись в стадии подготовки). Данные секвенирования были сведены в таблицу и объединены с фенотипической информацией (таблицы S2 и S4). Физико-химические свойства мутантов и их связь с фенотипической информацией были проанализированы с использованием R.

ЕС стремится к «конкретным» улучшениям Privacy Shield, поскольку правозащитная группа называет это соглашение «большой ошибкой» - EURACTIV.com

Европейская комиссия призвала предпринять ряд «конкретных шагов» для улучшения соглашения о передаче данных между ЕС и США - Privacy Shield.Между тем группа по защите данных Access Now выступила с критикой соглашения и призвала его приостановить.

Выступая на презентации третьего ежегодного обзора соглашения Privacy Shield в среду (23 октября), комиссар юстиции Вера Йоурова заявила, что диалог с американскими коллегами будет продолжен, чтобы «укрепить Shield, в том числе когда дело доходит до надзора, правоприменения. и, в более долгосрочной перспективе, для увеличения конвергенции наших систем ».

Соглашение Privacy Shield обязывает американские компании защищать личные данные, принадлежащие гражданам ЕС, в соответствии со стандартами ЕС и правами потребителей.Он также устанавливает структуру, которая позволяет безопасно передавать данные через Атлантику в коммерческих целях.

В рамках публикации обзора в среду Комиссия заявила, что необходимо внести улучшения в передачу персональных данных в ЕС, «чтобы лучше обеспечить эффективное функционирование Privacy Shield на практике».

Особые улучшения

Комиссия заявляет, что конкретные области, требующие поддержки, включают сокращение времени для компаний, которые хотят быть (повторно) сертифицированы как соответствующие соглашению, обеспечение более комплексного проведения проверок соответствия, включая пресечение компаний, которые ложно утверждают, что соблюдают стандарты ЕС по защите данных, и разъясняют правила обращения компаний с данными, принадлежащими работникам из ЕС в их собственной компании.

Что касается соблюдения, Комиссия также призвала Федеральную торговую комиссию активизировать свою игру с точки зрения расследования компаний, которые утверждают, что соблюдают правила защиты данных ЕС, но на самом деле этого не делают.

«История успеха»

Однако, что более позитивно, Журова до сих пор обращала внимание на общую «историю успеха» соглашения. «Программа Privacy Shield, в которой участвуют почти 5000 компаний, стала историей успеха. Ежегодный обзор - это важная проверка его работоспособности », - сказала она.

Утверждается, что формальности надзора со стороны Министерства торговли США улучшились, и в настоящее время проводятся ежемесячные проверки для проверки соблюдения принципов Privacy Shield.

Кроме того, были усилены правоприменительные меры: обзор, проведенный в среду, показал, что было возбуждено семь дел, связанных с Privacy Shield, для обеспечения справедливого соблюдения правил.

В среду Джоурова привела в качестве примера эффективности действий Федеральной торговой комиссии в этой области Facebook о штрафах в размере 5 миллиардов долларов, которые были выплачены Facebook ранее в этом году, чтобы провести государственное расследование в отношении его политики конфиденциальности.

Комиссия также заявляет, что «все большее число» граждан ЕС также «используют свои права по программе Privacy Shield».

И, после назначения в июне технического бизнесмена Кита Краха постоянным омбудсменом программы Privacy Shield, в дополнение к двум последним вакансиям в Совете по надзору за соблюдением конфиденциальности и гражданскими свободами, команда Privacy Shield в США теперь полностью укомплектована персоналом для первой время с 2016 года.

Но пока Комиссия приветствует такой шаг, Джованни Буттарелли, покойный надзорный орган ЕС по защите данных, ранее сказал EURACTIV, что такие назначения были «не уступкой», а скорее «предварительным условием для функционирования защиты конфиденциальности.”

В среду Йоурова признала, что это действительно так. «Это правда, что мы довольно долго ждали» назначения постоянного омбудсмена, - сказала она, добавив, что Крач прошел «очень строгий и общественный контроль» накануне своего назначения.

Большая ошибка?

Несмотря на относительно теплую оценку Комиссией эффективности Privacy Shield, в среду защитники конфиденциальности высказали и другие более насущные опасения по поводу соглашения.

Эстель Массе, старший аналитик группы цифровых прав Access Now, заявила, что соглашение не дает гражданам ЕС достаточной гарантии защиты их данных при пересылке через Атлантику. «Комиссия совершает большую ошибку, сохраняя Privacy Shield», - заявила она в среду.

«Эта структура никогда не подходила для защиты прав людей на неприкосновенность частной жизни и защиту данных. ЕС не только допускает постоянное нарушение основных прав в рамках этой договоренности, но также подрывает свою глобальную лидирующую роль в защите личных данных.”

Между тем, члены Европарламента были столь же резкими. Депутат Европарламента Renew Мориц Кёрнер заявил, что соглашение «не работает на практике» и что оно «не гарантирует достаточной правовой безопасности», добавив, что его «необходимо приостановить».

«Пока Европа уделяет внимание защите данных, а США -« сокровищнице »данных граждан ЕС, не будет действующего трансатлантического соглашения», - сказал он.

[Под редакцией Зорана Радосавлевича]

Этот бушующий свет: Цыпленок, освещенный средой Обзор

«Пройди через это.Просто переживи этот день. О других побеспокойся позже ».

«Я адское огненное чудовище и не дрогну».

После срыва отца и решения матери уехать из города на неопределенный срок, чтобы перегруппироваться, семнадцатилетняя Люсиль оказывается одна с растущими счетами, истощением еды и своей младшей сестрой Рен, которую она отчаянно пытается оградить от всего, что быстро собирается ад.

Но из-за того, что в ее жизни отсутствует так много вещей, Люсиль не знает, что делать, когда начинают появляться другие вещи - например, неудобные чувства к брату-близнецу ее лучшей подруги Иден, волшебные поставки еды и ее изменяющиеся отношения с Иденом.

Люсиль привыкла к ответственности и знает, что если она будет делать все по шагам, она со всем справится. Она может найти работу, она может позаботиться о Рене, она может сделать так, чтобы никто не заметил, что их мать явно отсутствует. Но Люсиль не уверена, сможет ли она сделать все это, держась за своего лучшего друга и, возможно, влюбившись в This Raging Light (2015) Эстель Лор.

Найдите в книжном магазине.

This Raging Light - потрясающий дебютный роман Лоры.

Я много видел себя и свои переживания, отраженные в истории Люсиль. Разговор об этой книге стал неотделим от разговора о моей жизни. Этот бешеный свет не был чем-то, что я даже знал, что мне нужно, пока я его не закончил.

Когда мне было за двадцать, я работал неполный рабочий день и брал большие долги. Было невероятно трудно наблюдать, как накапливается этот долг, и осознавать, что отступать было не на кого. За это же время мою мать дважды госпитализировали, и какое-то время все было в порядке.Хуже того, в первый раз у меня почти не было системы поддержки и никому, с кем я чувствовал себя комфортно, разговаривая о происходящем.

Те годы были одними из самых трудных в моей жизни, и даже сейчас о них труднее всего говорить. Я приходил домой много ночей и плакал, пока у меня не закончились слезы. Я был измотан и уверен, что больше ни с чем не справлюсь. Но я вставал каждый день и делал все это снова и снова. Я продолжал идти. Это было тяжело и ужасно, но теперь я знаю, что могу справиться со всем - со всем - благодаря тому времени в моей жизни.

This Raging Light - это такая история, а Люсиль - такой персонаж. Она непреднамеренный герой и обычная девушка. Она напугана, отважна и сильна. Я так рад, что читатели встречают такую ​​девушку, как Люсиль, которая преодолевает все препятствия и продолжает идти вперед, потому что это единственный выход.

Нет простого способа сказать это: This Raging Light - настоящий удар для чтения, особенно последняя треть. Но вот в чем дело: настоящая жизнь тоже такая.Лауре мастерски фиксирует, как все обостряется и кажется, что все происходит сразу в любой ситуации сильного беспокойства.

История Люсиль мрачна и задумчива. Есть романтика, но есть также темы семьи и выживания, поскольку Люсиль работает над созданием системы поддержки для себя с нуля. То, как Люсиль ведет свою жизнь, чрезвычайно реалистично и хорошо продумано на протяжении всего романа. То, как складывается все ужасное, и то, как Люсиль часто не может дышать, является подлинным и невероятно хорошо передано ее уникальным повествовательным голосом.

This Raging Light - переворот страницы о первой любви и внутренней силе. Это вдохновляющий роман о том, чтобы никогда не сдаваться и выживать. Настоятельно рекомендуется. Не могу дождаться, чтобы увидеть, что сделает Лора дальше.

Возможные пары: Suffer Love Эшли Херринг Блейк, Морская звезда Акеми Доун Боуман, Научи меня забыть Эрика М. Чепмен, Правила Элисон Кэтрин Кларк, Как любить Кэти Котугно , What Happened to Goodbye Сара Дессен, Никто здесь не одинок Сара Эверетт, В маленьком городке умирают все известные Бонни-Сью Хичкок, Если я исправлю вас Эбигейл Джонсон, Golden Джесси Кирби, We Were Liars Э.Локхарт, Когда мы столкнулись Эмери Лорд, Небо везде Дженди Нельсон, Удивительный цвет After Эмили X.R. Пан, Я принцесса X Чери Прист, Габи, Девушка в деталях Изабель Кинтеро, Элеонора и Парк Радуга Роуэлл, Я не твоя идеальная мексиканская дочь Эрика Л. Санчес, Начало всего Робин Шнайдер, Эта обычная жизнь Дженнифер Уолкап, Пропавшая Эбби Ли Уэтерли

* Эта книга была приобретена для рассмотрения у издателя на выставке BEA 2015 *

Вы также можете посмотреть мое интервью с Эстель об этой книге!

Нравится:

Нравится Загрузка...

Связанные

Будущее «Спенсера», More Emmy Gripes («Сюжет», «Йеллоустон»), «Щ.И.Т.» Любовь и многое другое

Добро пожаловать в раздел вопросов и ответов с телевизионным критиком, которого некоторые телезрители также называют своим «телевизионным терапевтом» - Мэттом Рушем, который попытается ответить на все, что вы любите, ненавидите, смущает, разочаровывает или взволновано сегодняшний обширный телевизионный ландшафт. (Мы знаем, что фоновая музыка слишком громкая, но всегда есть субтитры.)

Одно предупреждение: это зона, свободная от спойлеров, поэтому мы не будем здесь рассказывать о предстоящих сюжетных линиях, если они уже не известны.Присылайте свои вопросы и комментарии по адресу [электронная почта защищена] (или используйте форму в конце столбца ) и подписывайтесь на меня в Twitter (@TVGMMattRoush). По вторникам и пятницам ищите колонки «Спроси Мэтта».

Не очень конфиденциально тоскует по большему

Спенсер

Вопрос: Будет ли сериал Спенсер конфиденциально , мартовский фильм Netflix с Марком Уолбергом и Уинстоном Дьюком в главных ролях? Это было отличное подразнить !! Я хочу, чтобы эта веселая пара раскрывала преступление.- Эстель C

Мэтт Руш: Вы не одиноки, и во время запуска фильма ходили слухи, что в конечном итоге он может превратиться в серию фильмов для Netflix, когда придет время. Ничего определенного не было объявлено, и это занятые люди - не только Уолберг, но и режиссер / продюсер Питер Берг - так что может потребоваться долгое ожидание (пандемия или нет), прежде чем Spenser снова наберет обороты, но я был бы удивлен, если это последнее, что мы видим в этом воплощении.(Помните, что Spenser: For Hire , с Робертом Уричем в главной роли, имел неплохой результат в середине 1980-х, даже породив краткий спин-офф 1989 года Человек по имени Ястреб с Эвери Брукс в главной роли.)

Заговор Эмми против

Америки ?

Комментарий: Я тоже ненавижу награды. Показательный пример: исключение канала HBO «Заговор против Америки» в номинациях на премию «Эмми» за актерское мастерство, сценарист или режиссер. Безумный! Мне понравилась книга, и я чувствовал, что серия больше, чем оправдывает ее.Весь состав, особенно Зоя Казан, был потрясающим. Я знаю, что сейчас существует много качественного телевидения, но не признавать шоу такого высокого качества, как это, просто неправильно. - Робин Б

Мэтт Руш: Не говоря уже о его своевременности как аллегорическом предостерегающем призыве против доморощенного фашизма. (Прочтите мой обзор.) Как я уже упоминал ранее, категории ограниченных сериалов, возможно, самые сложные и наиболее наполненные лучшими талантами - некоторые из них, например Кейт Бланшетт из Mrs. America , очень мало занимаются телевидением.В ущерб этой конкретной области я чувствовал, что сюжет , скорее всего, не дотянул до топ-листа, а сила HBO направилась к Watchmen , что и произошло. (Единственным «сюрпризом» номинанта ограниченной серии является более тихий Unorthodox от Netflix, но я не могу утверждать, что он был не таким достойным. Все они достойны.)

A

Voice Unheard at the Emmys

Вопрос: Как вы думаете, Самый громкий голос был отвергнут, потому что неприятная тема - это то, о чем новостные и развлекательные компании хотят забыть? Награды просто вернут его.- Без подписи

Мэтт Руш: Глубже погрузившись в категории Эмми, я был поражен, узнав, что Voice даже не получил номинацию на преобразование макияжа Рассела Кроу! Я уже говорил об этом раньше, когда речь шла о документальной драме Роджера Эйлса, но именно из-за такого уровня споров и неприятностей в средствах массовой информации его история не только вдохновила ограниченный сериал премиум-класса на кабельном телевидении, но и получила оскароносный (за макияж / прическу) художественный фильм Бомба .Причина, по которой она не попала в число участников конкурса «Эмми», связана не столько с предметом обсуждения, сколько с избытком потенциальных кандидатов. (Я до сих пор оцениваю упущение Кроу вместе с Бобом Оденкирком, не номинированным на премию Better Call Saul , как два самых шокирующих в этом году.)

Мама голосует за

Йеллоустон

Комментарий: Я думаю, что пропустил награду показать однажды, когда у меня был ребенок. Я оставил надежды на Outlander , но пренебрежение Yellowstone , одной из лучших серий когда-либо, было непростительно.Воткните в меня вилку. Я так сделал, сделал, сделал. - Maria W

Matt Roush: Надеюсь, вы держите эти вилки в недоступном для детей месте. Но да, в другое время (скажем, до Netflix) трудно представить, чтобы этот сериал и особенно такие таланты, как Кевин Костнер и свирепый похититель сцен Келли Рейли, игнорировались.

S.H.I.E.L.D. Выйдя на вершину счастья

Комментарий: Не совсем вопрос, скорее утверждение.Я беременна, это пандемия, и за последние пять месяцев я не обнаружила особого эскапизма. Единственным ярким пятном в этом мрачном пейзаже стал продолжающийся последний сезон сериала Marvel’s Agents of S.H.I.E.L.D. Очевидно, что все участники решили просто ВЕСЕЛАТЬ. Карточки с названиями меняются каждую неделю, чтобы соответствовать теме эпизода, намек на «Максимальный запас» и даже превращение эпизода с временной петлей в тайну убийства. Я только надеюсь, что финал сериала на следующей неделе будет таким же эмоционально удовлетворительным, как финал 5-го сезона (который был задуман как финал сериала в случае, если они не были продлены).Я знаю, что это конец Marvel TV в прямом эфире, и я наслаждаюсь КАЖДОЙ минутой этого. Тем более, что я понятия не имею, что будет осенью, учитывая, что я не думаю, что кто-то еще возобновил производство. - VP

Matt Roush: По мере того, как серия приближается к концу, я слышу от довольно многих S.H.I.E.L.D. фанатов, что все идет на пике. Это именно то, чего вы хотите после столь долгого следования его диким путем. И да, в то время как телеиндустрия, похоже, осторожно возвращается к жизни, перспективы того, как и когда ожидать начала осеннего сезона, остаются туманными.

In

Terror of Limbo

Вопрос : Я только что закончил смотреть первые два сезона сериала The Terror и мне понравилось сочетание истории с ужасом. В то время как ощущения от двух сезонов были разными, повествование и игра были превосходными, и все же Эмми не любила. Когда нам ждать 3-й сезон? - Без подписи

Мэтт Руш: Не скоро, если вообще. Руководители AMC положительно высказались о разработке будущих сезонов антологии, если появится нужная история, но ничего не было объявлено, и, учитывая всю текущую неопределенность в бизнесе, может пройти некоторое время, прежде чем мы услышим о зеленом свете.Однако я согласен с тем, что использование истории в качестве фона для оригинальной истории ужасов полно возможностей. Если вам понравился фильм The Terror , то в конце этого месяца HBO разрабатывает аналогичную территорию со своим амбициозным (хотя и запутанным) Lovecraft Country , в котором монстры и другие устройства культового ужаса используются в качестве метафор для расизма Джима Кроу в Америке 1950-х годов. Немного ужаса прямо здесь.

На этом пока все. Как всегда, спасибо за чтение и помните, что я не могу сделать это без вашего участия, поэтому, пожалуйста, продолжайте присылать вопросы и комментарии о телевидении на [адрес электронной почты] или напишите мне в Twitter (@TVGMMattRoush), и вы также можете отправить вопросы через удобную форму ниже.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *